简介
蜕膜免疫细胞群是母胎免疫耐受的生物学基础，其构成极为特殊，主要由特殊类型的 NK 细胞（CD56 hrighCD16-）（～70%）、T 细胞（～10%）和单核巨噬细胞（～15%）等组成，它们通过表达特殊活化标志和产生大量的细胞因子，在母胎界面局部发挥着不同于外周的免疫调节作用，形成 Th2 亚群免疫优势，并通过旁分泌作用调控滋养细胞的生长、分化和迁移，从而对妊娠的维持起重要的局部调节作用。
原理
人蜕膜免疫细胞的分离及纯化的基本原理是人早孕期（7～9 周）子宫蜕膜中聚集着大量的免疫功能相关细胞，从流产组织中取出蜕膜，通过酶消化后研磨过滤，并进行密度梯度离心，然后吸取 40%～60% 密度层中的单个核细胞，通过短期培养可以初步获得蜕膜免疫细胞。然后根据不同细胞群的形态、表型及功能特点，应用进行免疫磁珠分选及流式细胞术分选等方法对细胞进行鉴定、分离和纯化，为进一步分析各亚群细胞结构和功能提供基础。
材料与仪器
试剂：
1 x PBS 液、D-Hanks 溶液、RBC 裂解液、DMEM/F12 培养液、胎牛血清、胶原酶 IV 型、DNA 酶 I 型、Percoll 原液、抗生素、MACS 缓冲液。
仪器：
眼科剪、镊子、不同规格筛网（100 目，300 目）、各类培养皿，注射器柄、不同规格塑料离心管、1.5 ml EP 管、吸管、台式冷冻离心机、磁极及磁珠分选柱、二氧化碳孵育箱、水浴摇床、流式细胞仪。
步骤
人蜕膜免疫细胞的分离及纯化的基本步骤可分为以下几步：
一、试剂配制
（1）RBC 裂解液配制：取 0.16 mol/L NH4Cl 90 ml（770.256 mg）；0.17 mol/L Tris（pH7.4）10 ml（205.938 mg）溶于三蒸水 100 ml，并用 HCl 调 pH 值至 7.2，定容至 200 ml。无菌裂解液需要用过滤法滤除细菌，不建议用高压灭菌。滤菌后 4 ℃ 保存。
（2）DMEM/F12 培养液配制：DMEM/F12 干粉 15.6 g 溶解于蒸馏水，加入 NaHCO3 1.2 g 混匀，定容至 1000 ml，用 56 g/L NaHCO3 溶液调 pH 值至 7.2～7.4，无菌条件下过滤除菌，分装后保存于 - 20 ℃。
（3）D-Hanks 液配制：取 NaCl 8.00 g，KCl 0.40 g，Na2HPO4·12 H20 0.12 g，KH2 HPO40.06 g，NaHCO3 0.35 g，无水葡萄糖 1.00 g，用三蒸水 1000 ml 溶解，调 pH6.8～7.0，分装于瓶中高压灭菌，冷却后放于 4 ℃ 保存待用。
（4）Percoll 溶液配制：Percoll 母液（Percoll 原液 9 ml，10 x PBS 1 ml）；20% Percoll 工作液（Percoll 母液 2 ml，1 x PBS 8 ml）；40% Percoll 工作液（Percoll 母液 4 ml，1 x PBS 6 ml）；60% Percoll 工作液（Percoll 母液 6 ml，1 x PBS 4 ml）。Percoll 工作液特性见表 14 - 1。
（5）MACS 缓冲液配制：1 x PBS 液（pH7.2），0.5% BSA，0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4 ℃ 保存。
二、蜕膜细胞预处理
（1）新鲜蜕膜组织用 1 x PBS 洗三遍，去除血凝块和血污，将剩余组织剪成大约 1 mm3 的碎块。
（2）加入 0.1% 胶原酶 IV（根据实验室条件可与 50 μg/ml DNase I 合并消化组织）于 37℃ 水浴振荡消化 1 小时后，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 细胞培养液终止消化。经 100 目筛网研磨过滤，获得细胞悬液后 300 g 离心 10 分钟，弃去上清。
（3）将细胞团重悬于 3 ml D-Hanks 液中，小心铺于不连续 Percoll 密度梯度界面（含 60%、40%、20% 三种梯度），1000 g 离心 20 分钟。
（4）吸取 40%～60% 梯度层之间的细胞（p ＝ 1.056～1.077），1xPBS 液洗涤 1 次，重悬于含 10% FBS 的 DMEM/F12 细胞培养液中。根据实验所需对蜕膜淋巴细胞进一步纯化分离。
三、分离纯化蜕膜 NK 细胞
（1）所获细胞种植于培养瓶中，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养过夜后换液，去除贴壁的蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞和蜕膜巨噬细胞，收取悬浮细胞即为初步纯化的蜕膜淋巴细胞。
（2）300 目滤网过滤经贴壁初次纯化的蜕膜淋巴细胞，去除细胞团块，离心，每 10＇细胞加入 40 μl MACS 缓冲液重悬细胞。
（3）每 107 细胞加入 10 μl NK Biotin 标记鸡尾酒混合抗体，混匀后 4 ℃ 孵育 10 分钟。
（4）再加入 30 μl MACS 缓冲液。
（5）每 107 细胞加入 20 μl NK microbeads，混匀，4 ℃ 孵育 15 分钟。
（6）细胞悬液 300 g 离心 10 分钟，用 500 μl MACS 缓冲液重悬细胞。
（7）于磁场内架设磁珠分选柱，3 ml 1 x PBS 缓冲液淋洗分选柱。
（8）将标记细胞悬液上柱，以 MACS 缓冲液 3 ml 洗柱 3 次。离开磁场后，以 MACS 缓冲液 3 ml 洗柱 3 次，流出分选柱的阳性选择细胞即为 NK 细胞。
（9）取 2 x 10/100 μl 所获细胞，标记 anti-CD3、anti-CD56、anti-CD16 抗体后，用 FACSAria 分析鉴定得到 CD56 brighCD3 NK 细胞的纯度。若需要纯度更高的蜕膜 NK 细胞，可用流式进一步分选 CD56 brighCD3 NK 细胞亚群，蜕膜 NK 细胞的分选纯度＞95%。
四、分离纯化蜕膜 CD4＋T 细胞
（1）所获细胞种植于培养瓶中，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养过夜后换液，去除贴壁的蜕膜基质细胞，蜕膜腺上皮细胞和蜕膜巨噬细胞，收取悬浮细胞即为纯化的蜕膜淋巴细胞。
（2）300 目滤网过滤去除细胞团块，离心，每 10＇细胞加入 100 μl MACS 缓冲液重悬细胞。
（3）每 107 细胞加入 20 μl anti-CD4-microbead，混匀，4℃ 孵育 15 分钟。
（4）加标记细胞总体积 10～20 倍的预冷 MACS 缓冲液洗涤，300 g 离心 10 分钟。
（5）每 10 细胞加入 100 μl MACS 缓冲液重悬细胞。
（6）于磁场内架设磁珠分选柱，3 ml MACS 缓冲液淋洗分选柱。
（7）将标记细胞悬液上柱，以 MACS 缓冲液 3 ml 洗柱 3 次，留在分选柱内为阳性选择所获 CD4＋T 细胞，加入 5 ml MACS 缓冲液，在解除磁场的情况下，压力冲洗出柱内细胞。
（8）换新分选柱重复分选，所获分选 CD4＋T 细胞纯度更高。
（9）取 2 x 105/100 μl 细胞，以 FITC 标记人 CD4 抗体室温避光孵育 25 分钟，PBS 洗 1 次；FACS 鉴定细胞纯度均＞95%。
五、分离纯化蜕膜树突状细胞
（1）所获细胞种植于培养瓶中，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中贴壁培养 2 小时后，获得不含 DSC 与 DEC 的蜕膜单个核细胞。
（2）悬浮细胞过 30μm 孔径滤网，去除细胞团，300 g 离心 10 分钟，每 10＇细胞加入 80 μl MACS 缓冲液，重悬细胞。
（3）每 10 细胞加入 15 μl Biotin 结合的 CD11c 抗体，混匀，4 ℃ 孵育 10 分钟。
（4）3 ml MACS 缓冲液洗涤 1 次。
（5）每 10＇细胞加入 12 μl microbead 结合的抗-Biotin，混匀，4 ℃ 孵育 15 分钟。
（6）离心细胞，用 500 μl MACS 缓冲液重悬细胞。
（7）于磁场内架设磁珠分选柱，3 ml1xPBS 缓冲液淋洗分选柱。
（8）将标记细胞悬液上柱，以 MACS 缓冲液 3 ml 洗柱 3 次，流出分选柱的阳性选择细胞即为蜕膜 DC。
（9）取 2 x 10/100 μl 所获细胞标记 anti-CD11c 表面抗体后，用 FACSAria 分析鉴定得到的蜕膜 CD11c＋DC 的纯度。若需要纯度更高的蜕膜 DC，可用流式进一步分选 CD11c＋DC 亚群
注意事项
1．尽量无菌取出蜕膜或绒毛组织，置于含有 100 IU/ml 青霉素和 100 mg/L 链霉素的预冷 D-Hanks 液或 10% 胎牛血清的完全培养液的无菌瓶中。保证组织在冰盒中最短时间内送往实验室。
2．组织尽量在生理盐水中漂洗，如果所得细胞悬液含红细胞较多，可以用红细胞裂解液裂解 2 分钟。
3．可将分离的单个核细胞在含 10% FBS 的 DMEM/F12 细胞培养液中进行体外培养，培养液加人 IL-15（10 ng/ml）和（或）IL-2（100 IU/ml）以维持蜕膜 NK 细胞的生长。每 3 天更换一半培养基并重新添加相应浓度的细胞因子。细胞可连续培养 7 至 14 天。蜕膜 NK 细胞表型应为 CD56brighCD16-CD3-。
来源：丁香实验
