染色体R显带技术

互联网2013-02-21

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一、原理

R显带的机理目前并不完全了解，在高温（80~90℃）的处理下诱发了染色体蛋白质的变化。Comings（1978）认为在高温下G带的中AT丰富区变性而显出特别亲染，但在R带中正恰相反，AT丰富区却并不显出亲染作用，故而显出浅染带区，电镜的观察进一步表明了这些带和间带区域的差异主要在于电子密度的不同，R带所显示之深浅带纹区域正同G带之带纹区域相反，即G带深染区R带为浅染区，反之亦然。

由于这种技术所显示深浅带纹正好与G带相反，故称逆相G带（Reverse G-band），故又称R带。在G带染色体的两末端都不显示深染，而在R带中则被染上深色，因此R带有利测定染色体长度以末端区域结构的变化。目前所用的R显带方法是RBG法（R-band by BrdU using Giemsa），即经BrdU处理后用Giemsa染色。

二、操作过程

1. 标本制作是在常规外周血培养72小时之后进行的，然后，加入胸腺嘧啶核苷使其最终浓度为0.3 μg/ml，继续培养17小时。

2. 无菌条件下，用Hank液洗二次，洗去胸腺嘧啶核苷余液，随后将外周血培养物转移入另一新鲜的培养液中，同时加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），使其生长培养液最终浓度为10微克/毫升，置于黑暗条件下在37℃中继续培养5小时。

3. 终止培养：按常规外周培养量加入秋水仙素于37℃中继续培养2~4小时，随后按常规培养进行离心、低渗、固定、制片。

4. 制作R带时，将玻片先放于Hoechst-33258工作液中染色20分钟、或是在吖啶橙工作液中染色5分钟，在用pH6.8磷酸缓冲液冲洗二次。

5. 将标本置于电热金属片上在恒温水浴箱上，然后玻片上铺满了pH=6.8磷酸缓冲液，使液体保存于45度左右的恒温。

6. 用8 W 紫外灯垂直于上述铺满了pH=6.8磷酸缓冲液的玻片上，灯管与玻片间距约5厘米，照射15~20分钟，随后用蒸馏水冲洗二次。

7. 将玻片浸于86度的Earle液中处理1~2分钟，随后用蒸馏水洗涤二次，冷却。

8. 用1：20 Giemsa稀释液染色10分钟，晾干。

9. 镜检和核型分析：用低倍镜转油镜观察计数，然后选好的分裂相，经显微摄影之后，按R带染色体特征进行分析，以检出异常。

三、注意事项

1. 染色体玻片不能用火烘干，只能让其自然干燥其效果较佳。

2. R显带制片不需经过高温烘片，存放时间也不易过长。

3. 紫外灯照射时间与Earle液处理时间呈反比，如紫外灯照射时间长，则在Earle液中处理时间则短。