转染和转染效率测定步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。
1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。
3. 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。
注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

表6. 在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐使用量 Table 6
Cell Line Cill/well(×10) LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(µl)
CHO-S 1.5 2.5-3.0
COS-7L 0.8 2.5-3.0
293H,293F 2.0 1.5-2.0

5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。
6. 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤

此步骤专门设计使用LIPOFECTAMINE，LIPOFECTIN，DMRIE-C或CELLFECTIN试剂在6孔板转染贴壁的哺乳动物细胞。
使用这些试剂时，欲得到最佳转染效率，条件的优化必不可少。参考右侧阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康的，正在增生的细胞和恒定的细胞密度对于可重复性的结果不可或缺。

1. 转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数并铺板，使转染日细胞融合度为70-90％。在铺板和转染期间避免使用抗生素。
2. 对每孔细胞，在100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ或D-MEM）中稀释1-2μg DNA。如有多孔细胞，可以批量制备。
3. 在每孔中，用100μl无血清的培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。阳离子脂质体试剂的每次稀释都使用单独的管。对于LIPOFECTIN，必须使用OPTI-MEMⅠ稀释并将稀释液在室温保温30分钟。
4. 将稀释的DNA（步骤2）同稀释的脂质体试剂（步骤3）混合。在室温保温15分钟。
5. 使用0.8ml/孔的转染培养基在转染开始前清洗细胞。转染培养基中可以含有血清。
6. 使用转染培养基稀释复合物至总体积1ml/管。将稀释的复合物加入细胞。5% CO2，37℃保温5小时。
7. 5小时后，增加培养基的体积至正常体积。如果转染培养基不含血清，加入血清，使其终浓度达到正常生长培养基的浓度。如欲使细胞生长最佳，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。
8. 转染24-48小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
注意：当转染不同大小培养板中的细胞时，根据表面积相应改变细胞，DNA，转染试剂以及培养基的量。

阳离子脂质体试剂和DNA的优化步骤

当使用除LIPOFECTAMINE PLUS试剂外的其他阳离子脂质体试剂进行转染时，如欲得到最佳转染效率，精心的优化必不可少。本实验步骤可以确定使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂所需的最佳脂质体试剂和DNA的量。

保持恒定的细胞密度以得到可重复的结果。阳离子脂质体试剂和DNA复合物在96孔板中制备（因为体积很小），然后加入24孔板中生长的细胞。转染的培养板按如下方式设置：

1. 转染前一天在24孔板中进行细胞铺板，使转染日细胞融合度为70-90％。
2. 在6个小离心管中，根据下表使用无血清培养基稀释阳离子脂质体试剂（其足够用于5孔细胞转染）。仅对LIPOFECTIN试剂，需要在室温保温稀释液30分钟。

Tube/Colum(µl) Volume Dilution Medium(µl) Volume Cationic Lipid Reagent
1 120 5
2 117.5 7.5
3 115 10
4 112.5 12.5
5 110 15
6 107.5 17.5

3. 将25μl稀释的阳离子脂质体试剂（步骤2）加入96孔板相应列的4个孔中（如上面图表）。
4. 在小离心管中，在140μl无血清培养基中加入下列量的DNA进行稀释。（足够用于7孔细胞转染。）

Tube/Row DNA(µg)
A 1.4
B 2.8
C 5.6
D 8.4

5. 在96孔板上每隔6孔（沿底部），在管A取出20μl加入。对管B，C和D重复同样步骤。将样品按上面图表所示排布。在室温保温15分钟。
6. 将要转染前，使用新鲜转染培养基清洗细胞。在加入稀释的复合物（步骤7）前除去清洗液。
7. 在含有DNA-阳离子脂质体试剂复合物的96孔板上，每孔加入160μl转染培养基（含有或不含有血清）。稍加混合。建议检测有无血清存在时的活性。
8. 将复合物加到24孔板的细胞中。
9. 5%CO2，37℃保温5小时。5小时后，加入含血清的完全培养基，使血清终浓度等同于正常生长培养基。如欲使细胞生长最佳，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基。
10. 转染24-48小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

注意：一旦确定了优化的条件，转染实验可以根据培养板表面积增加的比例线性放大。6孔板中得到的优化条件已经成功放大到100mm平皿上。建议的阳离子脂质体和DNA量的范围列在下面。

表11. 使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂进行转染的用量范围 Table 11
Culture Vessel DNA(µg) Cationic Lipid Reagent(µl) Transfection Medium Volume
35-mm 1-2 2-25 0.8
60-mm 3-6 6-75 2.4
100-mm 8-16 16-200

转染细胞的β-gal原位染色

1. 此实验步骤针对固定细胞β-gal表达的检测。这是用来确定转染效率的方便快捷的方法。此方法在6孔板上进行，由Sanes的方法修正而来。对于不同大小的培养器皿，根据培养板的表面积比来扩大或缩小溶液的量。此步骤可以用于悬浮细胞。使用2×106转染的细胞（来自6孔板转染），轻轻将细胞离心下来，使用和培养板上润洗细胞相同的方法。轻柔地处理细胞，不能振荡，并以尽可能低的速度离心。

贮液：
20mg/ml的X-gal溶解于二甲亚砜（－20℃，贮存于聚丙烯试管中，避光）。
注意：用玻璃移液管或者聚丙烯吸头来定量二甲亚砜溶液。二甲亚砜能溶解聚苯乙烯。
50mM铁氰化钾（贮存在4℃）。
50mM亚铁氰化钾（贮存在4℃）。

工作液：
固定液：含有2%甲酰胺，0.05％戊二醛D－PBS（贮存于4℃）

配制方法如下：
85ml蒸馏水
10ml不含钙和镁的10X D－PBS（Cat.No.14200-075）（27mM KCl，11mM KHPO4，1.4mM NaCl，81mM Na2HPO4·7H2O）
5ml福尔马林（37％甲醛溶液）
0.2ml戊二醛（25%溶液）

染液：含有5mM 铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM氯化镁的D－PBS（贮存在4℃）。
配制方法如下：
70ml蒸馏水
10ml 10×D-PBS
10ml 50mM 亚铁氰化钾
10ml 50mM 铁氰化钾
0.2ml 1M 氯化镁
底物/染液：染液含有1mg/ml X-gal
以下试剂即配即用：
20ml染液
1ml X-gal（20mg/ml）

步骤：
1. 用质粒pCMV·SPORT-βgal转染，使其表达24小时以上。
2. 每孔用2ml含有钙镁的D-PBS（Cat.No.14040-133）洗细胞一次。
3. 在室温用1ml固定液固定细胞5分钟。
4. 每孔用2ml D-PBS洗两次。
5. 每孔加入底物/染液溶液1ml并在室温或者37℃温育2小时至过夜。
6. 每孔加入2mlD-PBS润洗，在倒置显微镜下观察细胞，并估计蓝色细胞（β－gal－阳性）的比例。
7. 如要保存培养板，每孔中加入1ml含有10%福尔马林的PBS，室温放置10分钟。用D-PBS润洗后4℃保存在PBS中。

在转染细胞抽提物中测定β-gal表达

此实验方法用于测定细胞抽提物中β-gal活性。可以测定从96孔板到100mm培养皿转染所得的活性。此方法可适用于悬浮细胞（参见步骤2注意事项）。

溶液
裂解液：0.1％ Triton X-100/0.1M Tris-HCl（pH8.0）。
450ml蒸馏水
50ml 1M Tris-HCl（pH8.0）
0.5ml Triton X-100去垢剂
100×Mg溶液
0.1M氯化镁
4.5M 2-巯基乙醇
4℃保存

0.1M磷酸钠（pH 7.5）
41ml 0.2M Na2HPO4
9ml 0.2M NaH2PO4
50ml蒸馏水

4mg/ml ONPG（o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）溶于含有2mM 2-巯基乙醇的0.1M磷酸钠（pH 7.5），4℃储存。

1M 碳酸钠水溶液

使用GENETICIN®筛选抗生素筛选稳定转染株

筛选所需的GENETICIN抗生素的量会因细胞类型，培养基和血清成分的不同而不同。另外，如果使用粉末GENETICIN抗生素，则需要计算每批抗生素的剂量，因为效价会波动。或者使用GENETICIN抗生素溶液，其活性会为100%。

一般使用100到1100μg/ml的GENETICIN抗生素浓度筛选稳定的转染株，使用一半的筛选剂量保持培养的抗性。在转染前，使用您的细胞进行一个剂量-反应分析以确定杀死细胞的最低抗生素浓度。可以使用稍高的浓度筛选稳定的转化子。

制备储液：50mg/ml
1. 样品计算：
标记效价：700μg/mg
如配制10ml，需要500mg活性药品。因此需要的总的干重为714mg。
2. 称量714mg GENETICIN抗生素。
3. 溶于10ml蒸馏水。
4. 无菌过滤。

或者，可以使用即时可用的溶液（无菌过滤），全效价为50mg/ml活性抗生素。

剂量-反应分析：
1. 制备不含青霉素或链霉素的完全培养基。
2. 加入0到22μl 50mg/ml的GENETICIN抗生素溶液（终浓度为0至1100μg/ml完全培养基，以100ug/ml梯度增加）。
3. 使用胰酶消化细胞，稀释到4000细胞/ml。
4. 在6孔板的每孔中加入100μl细胞悬浮液，每孔中已预先加入2ml含稀释GENETICIN抗生素的培养基。将培养板在湿润的5%CO2中37℃温育。每周使用含GENETICIN抗生素的新鲜培养基更换培养基两次。
5. 在10到14天，除去培养基，使用含钙离子和镁离子的D-PBS清洗细胞。使用溶于50%甲醇的0.5%亚甲基蓝染色细胞20分钟。
6. 确定杀死所有细胞的GENETICIN抗生素最低浓度。使用紧邻的稍高的浓度进行筛选。

转染和筛选：
1. 使用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒（如pSV2neo）转染细胞。
2. 转染后第二天，将细胞传代，给细胞分裂的空间（根据细胞生长的速度，一般1:10到1:40可以达到效果）。
3. 转染后2-3天，开始使用抗生素。将转染的细胞在含抗生素的培养基中培养，抗生素的浓度由剂量-反应分析确定。含抗生素的培养基每周更换两次。
4. 10到14天后，可以观察到抗性克隆，未转染的对照应该没有细胞生长。可以根据需要固定，染色，传代或克隆抗性细胞。