如何有效提高转染效率

1.转染技术介绍

近几年，转基因研究已经成为分子生物学领域的研究热点，范围已经渗透到医学，农业等多个领域。在转基因动物的制备过程中需要经历基因克隆、细胞转染、胚胎移植等几个步骤，而细胞转染技术则是此过程中的重要环节。

细胞转染技术是采用一定的方法和途径将外源核酸分子如 DNA、RNA 等导入特定的细胞并表达目的基因，产生特定功能的蛋白质分子。在生产转基因动物的研究中，通过结合细胞转染技术与体细胞克隆技术培育转基因动物是一条非常有效的途径。选择合适的细胞转染方法并进行优化，将会得到较高的转染效率，从而可以间接提高转基因克隆技术的效率。

原代细胞难以转染是公认的问题，因此选择一种合适的转染试剂，提高原代细胞的转染效率，是后续阳性细胞的筛选、核移植试验以及转基因动物产生的重要前提。目前最为常用的转染方法有脂质体转染法、磷酸钙转染法、电穿孔法、病毒介导的转染等。

据报道病毒介导的细胞转染技术是目前常用的转染方法，慢病毒载体可以作为一种有效的基因运载工具，并能够在胞内稳定表达。阳离子脂质体作为一种有效的基因传递载体具有下列特点：对细胞类型有选择性，转染效果随细胞类型变化大，对 DNA 的质量要求高，但操作简便，成本适中且细胞毒性低。

电穿孔技术在 20 世纪 80 年代初期开始用于将 DNA 导入多种动物细胞，理论上可以转染几乎所有类型细胞。较之脂质体转染，电穿孔法有使用方便、转染效率高、外源基因通常以单拷贝形式整合等诸多优点，但伴随较高的细胞毒性。

2. 转染效率影响因素及转染技巧

（1）转染效率影响因素

转染细胞状态：

首先，不同种类的细胞本身在转染效率上的差距就很大，比如贴壁细胞和悬浮细胞之间转染差距就很显着，天生趋于悬浮的细胞就难以转染。因为这两种不同状态的细胞浆膜结构不一样，可能导致了某些细胞类型天生的难以转染，所以寻找高效的转染试剂应对这类型细胞就显得尤为重要。

细胞在不同分裂期，摄取并表达外源 DNA 的能力也有显着性差异。因此选择合适的培养状态的细胞对转染也有着不小的影响，此外还常用一些促有丝分裂刺激物（条件培养基，生长因子，滋养细胞）来活化原代培养细胞。

细胞在冻存复苏后一到两代或直到它们完全复苏之前都是很难转染的，但是传代次数过多，对于转染而言，在不同细胞系中表现出来的差异也很大。有些细胞系传代很多次还能够保证很高的转染效率，而其他一些细胞系则传代很少次数转染效率就有显着差异。

因为有些细胞系是不稳定的，可能随着培养时间的改变，培养条件的不同，不同的选择压力，可能引起不同的克隆选择。因此就算是同一个细胞系，在不同条件下转染能力的差异可能会很大。

载体核酸：

首先要保证所转染核酸的正确性和完整性，超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力和污染物（如内毒素等）都会影响到转染效率。

其次是载体构造，如启动子、增强子、Ori 等。转染体系中一般都带有强病毒调节元件 （如 RSV、CMV 和 SV40） 的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子、增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40 体系可高效表达 large T 抗原 （如，COS）；而在其他许多细胞系中，则是 CMV 启动子更为有效。除此之外，各种 CMV 载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。所以选择适当的载体结构，对转染成功起到非常重要的作用。

（2）转染技巧

首先，选择最高效的实验材料，包括相对应的细胞系、载体。现在市面上转染试剂市场已经非常成熟，对于各种不同的实验条件，选择合适的转染试剂。

根据选择的转染试剂，根据说明书要求制备转染复合物，其中转染试剂/DNA 配比，离子强度，pH 值等因素都有可能影响到转染效率。应该注意的是，一般情况下要求在不含血清或者其他蛋白的培养基中制备转染复合物，因为它们会对转染产生抑制效果。

制备转染复合物的最佳孵育时间，不同转染试剂之间的差别非常巨大，但是这是非常关键的一个环节，直接影响到转染复合物制备的质量，所以应该严格按照说明书上的孵育时间进行。

导致实验失败的还有很大一部分原因是因为污染问题，包括 DNA 污染，细菌、真菌、病毒、支原体等微生物污染，和不同实验之前的不同细胞的交叉污染。养成良好的实验室习惯，时刻注意污染源存在，谨防实验材料和污染源接触，建立严格的细胞系鉴定标准，才能尽可能的杜绝污染问题超出的实验损失。

3. 常规细胞系转染试剂 MegaTran1.0

MegaTran 1.0 是一款新型的非脂质体聚合物转染试剂，特别适于大量 DNA 的转染，包括瞬时转染获得过表达蛋白和利用 cDNA 芯片或 shRNA 文库做高通量筛选。

ü 与目前最常用的转染试剂相比，转染效率更高

ü 对 293F 悬浮细胞有效

ü 通过瞬时转染可增加蛋白产量

ü 毒性低

ü 实用 - 10 毫升仅需￥14 440

高转染效率

CHO-K1 细胞转染带有 GFP 的表达质粒后，流式细胞术分析 GFP 的表达。细胞用 9ul 转染试剂转染 3 ug DNA。转染 72 小时后，胰蛋白酶收集 CHO-K1 细胞，并通过流式细胞仪分析。Y 轴为伴随增长的强度所表达 GFP 的细胞数目。左侧的图标是未转染的对照。用 MegaTran 1.0 转染效率为 95%（右侧图标），用某公司常见同类型转染试剂转染效率为 63%（中间图标）。

293F 悬浮细胞转染

用不同数目的编码人的-IgG-GPI 质粒和 MegaTran 1.0 或某公司常见同类型转染试剂转染 293F 悬浮细胞。转染 72 小时后，通过流式细胞术用抗人的 IgG-FITC 分析细胞表达表面 IgG 的数目。

在此试验中，MegaTran 1.0 对 293F 悬浮细胞的转染效率达 80%，与 293Fectin 类似。

高表达转基因蛋白

结合高转染效率和低毒性，MegaTran 1.0 转染细胞可以表达更高水平的转基因蛋白。

用 IgG 载体瞬时转染到 CHO-K1 细胞系。CHO-K1 细胞用含有两种不同单抗基因的质粒转染。转染后第三天和第六天，表面 IgG 滴度用 Octet 测定。图示标明用 MegaTran 1.0 转染后，在第 3 天和第 6 天，表达水平增加 35-60%。

4. 原代细胞系转染试剂-TurboFectin 8.0

TurboFectin8.0 转染试剂是针对核酸转染真核细胞所优化的一种高效率的新型转染试剂，是一种脂质体和组蛋白的混合物，溶解在 80% 的乙醇中。适用于在各种不同的细胞类型中转染 TrueClone/TrueORF Clone（过表达）和 HuSH-29 表达载体（shRNA 用于抑制表达）。同时其也是适用于 GFC-Transfection Arrays 的最优化反转录试剂。

ü 应用范围广： TurboFectin8.0 已经成功应用于超过 100 种细胞系和原代细胞。

ü 适用于 shRNA 诱导的沉默 .

ü 反向转染验证的首选试剂。

ü 使用简易： 在含有抗体和抗真菌试剂的培养基中的转染效果不受影响；适合含有血清培养基；无须进行培养基更换。

ü 性价比高： 1 ml 的 TurboFection8.0 可以适用于转染 300-500 次的 6 孔平皿培养。平均每次的转染费用少于 5 元。

5. 创新型细胞转染试剂 Viromer

Viromer 是利用病毒融合机制（因此得名）可以将 plasmid 和 siRNA 等外源核酸转染到目的细胞中的一项突破性技术。

ü 超高的转染效率，体内降解能力强，能最大的提高转染效率降背景。

ü 使用简单，不需要去除血清和抗生素

ü 无脂质成分，不参与细胞内代谢

ü 反向转染，适用于高通量筛选

ü 适用于难转染的细胞

-原代细胞

-分化细胞和干细胞

-悬浮细胞

Viromer Red （DNA Transfection）， RAW 264.7

6.siRNA 的转染试剂-siTran 1.0

siTran 1.0 专为转染双链 siRNA 而设计，可用于瞬时转染、高通量筛选等；siTran 1.0 也可高效转染质粒 DNA。

ü 双功能转染试剂——共转染 siRNA 和相对应的 cDNA 克隆

ü 高转染效率和低细胞毒性

参考文献

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