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如何优化高压基因枪的转染效率

威泰克

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基因枪法一直被认为是最直接、应用范围最广的外源基因导入技术。但由于传统基因枪技术需要靠高压气体驱动,这就带来一个问题:被轰击的中心区域由于气体冲击力过大,会导致被轰击区域大量靶细胞死亡,大量的投递被浪费掉,严重制约了基因枪法投递的转化效率。

实践中,利用传统高压手持基因枪尝试将potato virus A (PVA; Puurand et al. 1996)病毒转染到烟草中时,发现氦气压力调节至 150 或 200 psi,距离样本 0 cm 时,可以 100% 转染成功,但是由于气压过高,烟草叶片轰击区域出现大面积细胞死亡;而尝试使用250 或300 psi气压轰击时,叶片会被撕碎;当使用 80 或 100 psi 轰击叶片时,叶片被轰击区域相对保持完好,但同时没有检测到成功转染的样品。

(Kekarainen, T., & Valkonen, J. P. T. (1995). Inoculation of viral RNA and cDNA to potato and tobacco plants using the Helios Gene Gun. Micro, 4–7.)

伯乐Helios高压手持基因枪轰击叶片细胞坏死凋亡
左图:传统高压手持基因枪150 psi/0 cm轰击烟草叶片造成轰击区域大面积细胞死亡
右图:左半叶100psi,右半叶80psi,下半叶0 cm距离轰击,上半叶2 cm轰击


如何让高压基因枪降低压力的同时,还能保持较高的转染效率?英国剑桥大学MRC分子生物学实验室Neurobiology部门在2001年,自行研发了一款专用配件:专门给高压手持基因枪定制的减压基因枪枪管:一根布满了 20 个挡板孔(减轻后坐力)的较细直径枪管,以代替原有高压枪管以及高压基因枪前端的隔离架。将原装枪管替换成这支低压枪管之后,原高压基因枪轰击面积更集中,并且发现将轰击压力调低到 100 psi 以下的压力就可以完成有效轰击,而且大大减少了对靶细胞的伤害。与此同时,这支新枪管在轰击时也允许枪口离靶细胞更近,并能将更多金粉微载体从 Tefzel 管(聚氟乙烯)“子弹”上射出,从而达到更高的轰击密度、更深的轰击深度以及更小的样品伤害。

(O'Brien J A, Holt M, Whiteside G, et al. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro Biolistic transfection of organotypic neuronal tissue[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2001, 112(1):57-64.)


高压枪管改造低压基因枪枪管


伯乐Helios高压手持式基因枪轰击密度低,低压枪管轰击密度高
在滤纸上对比高压、低压两种基因枪枪管在不同压力、不同距离下的轰击密度


伯乐Helios高压手持式基因枪轰击琼脂糖凝胶穿透力较低
琼脂糖凝胶穿透结果:图片上端代表凝胶顶部。可以看出改进后的低压基因枪枪管在更低的轰击压力下,不同距离的轰击穿透力均优于未改进的基因枪枪管



伯乐Helios高压手持式基因枪穿透力不如低压枪管
同样距离下(40 mm):实心曲线代表改进后的基因枪枪管在不同压力下的琼脂糖凝胶穿透能力,空心曲线代表未改进的基因枪枪管在不同压力下的琼脂糖凝胶穿透能力



伯乐Helios高压手持式基因枪转染效率低,细胞死亡率高,免疫反应不如低压枪管
(a) HeLa细胞培养物的基因枪轰击:左图为通过Hoechst染色从而观察细胞死亡以及细胞凋亡情况;右图为通过 EYFP 荧光蛋白观察成功转染的情况。可以看出改进后的低压基因枪枪管轰击后细胞损失量小,合适的条件下仅产生非常有限的细胞凋亡,并可以取得很高的转染效率 (b) 定量分析 HeLa 与 HEK293 细胞培养物的基因枪轰击,实心曲线代表改进后的低压基因枪枪管转染效率,空心曲线代表未改进的基因枪枪管转染效率。可以看出改进后的低压基因枪枪管在贴近样品时,轰击的转染效率远高于原高压基因枪枪管。


美国WEALTEC公司GDS-80低压手持式基因枪
GDS-80低压手持式基因枪


美国 WEALTEC 公司认为低压驱动便携式气体基因枪才是未来的发展趋势,在产品研发中重新设计了基因枪枪管的内部结构,着重优化了枪管中的气体加速效率,推出了第三代便携式低压手持式基因枪 GDS-80,为动物、植物实验分别设计了不同口径的枪管,使得在低压输出条件下(动物细胞一般仅需要 15-45 psi,植物细胞一般仅需 50-60 psi),基因枪法导入技术在动物、植物应用方面均可以达到很高转染效率。

美国WEALTEC公司GDS-80低压手持式基因枪轰击烟草叶片基因表达
美国WEALTEC公司GDS-80低压手持式基因枪轰击活体烟草叶片基因表达效果
上图中展示了GDS-80在40 psi压力下,不同轰击距离在烟草叶片上的表达效果


在 Springer 出版的分子生物学方法学系列(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY™)著作中,Stephan Sudowe编写的《基因枪 DNA 传递方法与实验》专门用一个章节介绍这款低压基因枪在小鼠实验中的表现。

美国WEALTEC公司GDS-80低压手持式基因枪动物活体实验轰击小鼠
低压手持式基因枪结构与小鼠实验操作图示
-《Biolistic DNA Delivery to Mice with the Low Pressure Gene Gun》


英国 MRC 实验室John A. O’Brien在老式高压基因枪减压枪管改进的文章中指出,在使用未经改进的枪管之前,使用 100 psi 或以下的压力轰击时,金粉很难从制弹的 Tefzel 管壁上被冲下来,在琼脂糖渗透测试中最深的渗透距离也仅为减压枪管的一半左右,并且对器官组织或分散的动物细胞不能达到很高的转染效果。并且在制弹时,乙醇需要在预混浆装载入Tefzel管中以后,在样品管制备站转动时从Tefzel管中立即抽出,否则金粉会与管壁结合过紧并且DNA无法均匀包被在金粉上,而即使减少PVP浓度也不能改善此问题。

伯乐Helios高压手持式基因枪PVP溶液需要高压轰击才能吹下
(注:PVP 是高压手持式基因枪制弹专用耗材包中的一种试剂,需在制弹中使用,其作用是帮助包被金粉颗粒的DNA或RNA微粒,能够在干燥后更强有力地粘在制弹用的 Tefzel 管壁上)


伯乐Helios高压手持式基因枪需要专用样品管制备站制弹
样品管制备站制备高压手持式基因枪的Tefzel管干式子弹


GDS-80 低压手持式基因枪摒弃了 Tefzel 管制弹的繁琐流程,采用火箭喷嘴枪管结构设计,在喉管处直接装载金粉-DNA 溶液或 Naked-DNA 溶液即可轰击,因此可以省去整个高压手持式基因枪需要的样品管制备站流程,更不需要使用PVP试剂让金粉粘附在Tefzel管上,阻滞轰击氦气时对微粒的加速。

美国WEALTEC公司GDS-80低压手持式基因枪可以将质粒溶液直接加入枪管
GDS-80基因枪样品孔直接装载DNA溶液


GDS-80 基因枪重构了枪管结构,并改进了装载 DNA 样品的方法,可以在低压条件下完成高效转染,不需要像传统高压台式基因枪一样,抽真空加高压靠挤爆破裂膜破裂网的震波轰击样本,同时,也不再像高压手持基因枪一样,需要用高压氦气震波将金粉粒子从Tefzel管壁上吹下。同时,对于动物实验中没有细胞壁保护的动物细胞,GDS-80 基因枪由于不再需要高压手持基因枪的金粉溶液干燥步骤,可以直接将样品在溶液状态用移液器加到枪管中,因此 GDS-80 基因枪开创性地摆脱了金粉的限制,可以直接轰击 Naked-DNA 到靶细胞中,并取得更理想的免疫效果。

基因枪金粉轰击与Naked DNA轰击效果对比
癌症治疗用基因枪投递金粉包被或 Naked pCMV-human-N’-neu DNA 疫苗,图示代表各实验组肿瘤体积随时间变化,平均肿瘤体积是在小鼠因肿瘤过大负担病死时测量的体积
(Lin C C, Yen M C, Lin C M, et al. Delivery of noncarrier naked DNA vaccine into the skin by supersonic flow induces a polarized T helper type 1 immune response to cancer[J]. Journal of Gene Medicine, 2008, 10(6):679-689.)

配置 DNA-金粉混合液流程很难做到无菌,并且工艺繁琐,但是 Naked DNA 疫苗制备就非常方便,并且相对无菌。另外,当用于人类临床实验时,如果不可生物降解的金粉钨粉微粒在人体内累积时,人体免疫反应可能会产生偏差,或导致与预期相反的副作用
(33 Ariyo OA, Atiri GI, Dixon AG, Winter S. The use of biolistic inoculation of cassava mosaic begomoviruses in screening cassava for resistance to cassava mosaic disease. J Virol Methods 2006; 137: 43–50.)

金粉包被的DNA疫苗在之前的研究中也显示出会在被轰击的皮肤区域产生灼伤效果。而如今的Naked DNA轰击技术可以很好地解决以上问题。相比于金粉包被DNA疫苗经常造成组织的轻微坏死与伤害,Naked DNA疫苗对机体组织的伤害较小。但之前的研究成果也有一部分原因可能是由于高压轰击造成。
(Cheng WF, Hung CF, Lin KY, Ling M, Juang J, He L et al. CD8+ T cells, NK cells and IFN-gamma are important for control of tumor with downregulated MHC class I expression by DNA vaccination. Gene Therapy 2003; 10: 1311–1320.)
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