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RNA甲醛变性胶电泳检测RNA质量的实验方法

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提取样品的总RNA后,一般根据RNA的凝胶电泳 图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构,因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳,得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。

一、试剂:

DEPC(Sigma公司产品),MOPs(Bocherigmer公司产品),甲酰胺(Formamide,Sigma公司产品),溴酚蓝(Bromphenol Blue,Sigma公司产品)。EDTA -Na2,氢氧化钠,醋酸钠,甲醛,甘油,分析纯,国产。

二、试剂配制:

1、DEPC 水的处理:用量筒量取去离子水 2L,在通风橱中,加入2ml DEPC到2升去离子水中,终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子,混匀,然后放在摇床中中速摇荡至少4hr,再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开,15磅灭菌20min。

2、10 × FA Buffer(formaldehyde agarose buffer:200 mM的MOPs,50 mM的NaAc,10 mM的EDTA):配制500ml,称取3.4g NaAC•3H2O放入1000ml烧杯中,加入400ml DEPC 处理过的去离子水,加入搅拌子,放在磁力搅拌器上溶解。

然后加入20.9g MOPs,放在磁力搅拌器上溶解。再加1.86g EDTA二水二钠,放在磁力搅拌器上溶解。用1M灭过菌的NaOH 调PH至7.0(约用NaOH 40ml),用DEPC 处理过的去离子水定容至500ml,装入棕色瓶中,写好标签,室温避光保存。

4、5 × 甲醛变性胶加样缓冲液(5×loading buffer): 配制10ml。预先配制水饱和的溴酚蓝溶液:在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝,加入1ml DEPC水溶解,充分振荡溶解,离心,可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余,上层液体即水饱和的溴酚蓝液。

在15ml灭菌离心管中,依次加入以下各种成分:4.0ml 10 × FA buffer3.1ml 甲酰胺2.0ml 100%的甘油720ul 37%的甲醛80ul0.5M的 EDTA (PH 8.0)16ul 水饱和的溴酚蓝100ul DEPC水混匀,分装,-20℃保存,常用放4℃保存。

5、1×甲醛变性胶电泳缓冲液(1×running buffer):20 ml 10×FA gel buffer,4.0 ml 37%的甲醛,176 ml水,放入电泳槽中使用,一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。

6、1.2%的甲醛变性胶:称0.4克琼脂糖,加入3.34 ml 10×FA gel buffer,加入30 ml DEPC水,微波炉融化,肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约50-60℃,再加入600 l甲醛,倒入7.5×5.0 cm的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子,室温放置约30min后即可使用。

三、实验方法

一般取0.3 g的总RNA,加入1/5体积的5×加样缓冲液,65℃加热5 min,冰上骤冷,以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭(EtBr,浓度1.0 mg/mL),而不在胶中加EtBr,这样电泳后的背景较低。

配好的1.2%的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min。图1是我们实验室用以上方法检测酵母总RNA的电泳图。

RNA甲醛变性胶电泳检测RNA质量的实验方法

图1 酵母total RNA的甲醛变性胶电泳。1,酵母total RNA(0.3 g);2,酵母total RNA(0.5 g);3,RNA Marker(0.2 g)。RNA的质量判断标准是有清晰的26S,18S条带,无降解,且肉眼观察26S条带亮度约是18S的1-2倍。

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