RNA的甲醛变性电泳

用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核内小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。

一、材料、试剂和仪器

1. 材料：植物总RNA 5-10 ug

2. 试剂

（1）加样运载缓冲液（Loading buffer）

50% 甘油

1 mmol/L EDTA （pH8.0）

0.25%溴酚蓝

25%二甲苯氰FF

（2）10xTAE Buffer

（3）5x甲醛凝胶电泳缓冲液：

0.1 mol/L MOPs （pH7.0）

40 mmol/L乙酸钠

5 mmol/L DETA（pH8.0）

（4）甲醛，甲酰胺

3. 仪器：电泳装置，紫外透射观测仪

二、实验程序

1. 甲醛变性的琼脂糖（Agarose） 凝胶的配制

在250 mL的锥形瓶中准确称量2 g Agarose （Sigama），再加20 mL 10xTAE Buffer，144 mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5 ug/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

2. RNA的甲醛变性电泳

（1） 样品制备

RNA总量：10 ug

5×甲醛凝胶电泳缓冲液：4 ul

甲醛： 3.5 ul

甲酰胺：10 ul

加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2 min（或55℃，15 min），取出后放入冰中冷却。

（2） 加入2 ul无菌的DEPC处理的加样运载液。（使用加样运载液的目的有三： 增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，便于加样操作；能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时，溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4 kb 的双链线状DNA相同。）

（3）将胶板浸没在1x甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5 V/cm预跑5 min。点样后3-4 V/cm电泳。

（4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8 cm处），紫外灯下观察， 照相。