甲醛变性电泳检测RNA完整性

一、材料、试剂和仪器

1、材料：植物总RNA 5-10μg

2、试剂：

1）加样运载缓冲液（Loading buffer）

50% 甘油
1mmol/L EDTA （pH 8.0）
0.25%溴酚蓝
25%二甲苯氰FF

2）10×TAE Buffer

3）5×甲醛凝胶电泳缓冲液：

0.1mol/L MOPs （pH7.0）
40mmol/L乙酸钠
5mmol/L DETA（pH8.0）

4）甲醛，甲酰胺

3、仪器：电泳装置，紫外透射观测仪

二、实验程序

1、甲醛变性的琼脂糖（Agarose） 凝胶的配制

在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

2、RNA的甲醛变性电泳

1） 样品制备

RNA总量10μg
5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺10μl

加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2min（或55℃，15min），取出后放入冰中冷却。

2） 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。（使用加样运载液的目的有三： 增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，便于加样操作；能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时，溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4kb 的双链线状DNA相同。）

3）将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。

4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8cm处），紫外灯下观察， 照相。