RNA的定量和完整性分析

RNA的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳，戊二醛变性电泳等。

甲醛变性电泳检测RNA完整性

一、材料、试剂和仪器

1 材料: 植物总RNA 5-10μg

2 试剂:

1）加样运载缓冲液（Loading buffer），50% 甘油，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.25%溴酚蓝，25%二甲苯氰FF

2）10×TAE Buffer

3）5×甲醛凝胶电泳缓冲液：，0.1mol/L MOPs (pH7.0)，40mmol/L乙酸钠，5mmol/L DETA(pH8.0)

4）甲醛, 甲酰胺

3 仪器: 电泳装置，紫外透射观测仪

二、实验程序

1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制

在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

2 RNA的甲醛变性电泳

1） 样品制备，RNA总量10μg，5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl，甲醛 3.5μl，甲酰胺10μl，加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2min(或55℃,15min)，取出后放入冰中冷却。

2） 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度, 以确保DNA均匀进入样品孔内; 使样品呈现颜色, 便于加样操作; 能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置. 以 0.5 X TBE作电泳液时, 溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳动速率与长 4kb 的双链线状DNA相同)

3）将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5V/cm预跑5min。点

样后3-4V/cm电泳。

4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8cm处），紫外灯下观察, 照相。