【交流】RNA的定量和完整性分析

RNA 的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳，戊二醛变性电泳等。

1 甲醛变性电泳检测RNA完整性

一、材料、试剂和仪器

1 材料: 植物总RNA 5-10μg

2 试剂：

1）加样运载缓冲液（Loading buffer）

50% 甘油

1mmol/L EDTA (pH 8.0)

0.25%溴酚蓝

25%二甲苯氰FF

2）10×TAE Buffer

3）5×甲醛凝胶电泳缓冲液：

0.1mol/L MOPs (pH7.0)

40mmol/L乙酸钠

5mmol/L DETA(pH8.0)

4）甲醛, 甲酰胺

3 仪器: 电泳装置，紫外透射观测仪

二、实验程序

1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制

在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

2 RNA的甲醛变性电泳

1） 样品制备

RNA总量10μg

5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl

甲醛 3.5μl

甲酰胺10μl

加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2min(或55℃,15min)，取出后放入冰中冷却。

2） 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度, 以确保DNA均匀进入样品孔内; 使样品呈现颜色, 便于加样操作; 能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置. 以 0.5 X TBE作电泳液时, 溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳动速率与长 4kb 的双链线状DNA相同)

3）将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。

4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8cm处），紫外灯下观察, 照相。

2 RNA含量和纯度的测定

一、材料，试剂和仪器

1 材料: 待检测的RNA样品

2 试剂: DEPC-H2O

3 仪器: 紫外分析仪，石英比色杯

1.开机设定参数 ，具体操作参照仪器说明 。

2.用DEPC-H2O做空白调零。

3.将RNA样品按一定的比例稀释于DEPC-H2O。

4.混匀样品后在230nm 、260nm、280nm和310nm波长下读数，还可扫描动态吸收图谱。

结果与分析

1. 完整的RNA的甲醛电泳可明显地观察到28S和18S两条带(见图3.1)，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显, 则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase, 或操作剧烈。

2. 定量测定DNA或RNA，应选260nm、230nm、 280nm和310nm波长读数。其中260nm读数用来估算样品中核酸浓度，310nm为背景吸收值。1个OD260值相当于40μg/mLRNA。

样品浓度（μg/mL）=[OD260- OD310]×稀释倍数×40

OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。

OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2说明去盐不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。