甲醛变性电泳

一、实验原理

提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。

二、实验试剂

1. DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2 L，在通风橱中，加入2 ml DEPC到2L去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4 h，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20 min。

2. 10×MOPS缓冲液（即10×FA缓冲液）： 500 ml

0.2 mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）

80 mmol/L NaAc

10 mmol/L EDTANa2

先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1 gNaAc后，加入10 ml 0.5 mol/L EDTA，定容500 ml。用0.22 mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。

或0.2 mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）

50 mmol/L NaAc

10 mmol/L EDTA

用2 mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时用DEPC水稀释。

3. 1×MOPS电泳缓冲液（即1×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer）：1 00 ml

10×MOPS 150 ml

37%甲醛 80 ml

加水至1 500 ml，一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。

4. 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）： 10 ml

预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1 mg溴酚蓝，加入1 ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：

4.0 ml 10 × FA buffer

3.1 ml 甲酰胺

2.0 ml 100%的甘油

720 ul 37%的甲醛

80 ul 0.5 MEDTA （pH 8.0）

16 ul 水饱和的溴酚蓝

100 ul DEPC水

混匀，分装，-20℃保存，常用放4℃保存。

或 甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）： 10

50%甘油

1 mmol/L EDTA

0.25% 溴酚蓝

0.25% 二甲苯氰

5 ml甘油、20 ul 0.5 mol/L EDTA、25 mg溴酚蓝、25 mg二甲苯氰，加DEPC水至10 ml，高压后，4°C保存。

三、实验设备

1. 电泳设备

2. 紫外灯

四、实验步骤

1. 电泳槽用0.3%H2O2浸泡30 min，DEPC水冲洗晾干。

2. 铺胶（40 ml）

琼脂糖 0.55 g

DEPC水 36 ml

10×MOPS 5 ml

37%甲醛 9 ml

称0.55克琼脂糖加36 ml DEPC水，微波炉加热溶解琼脂糖，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至50-60℃，加9 ml 甲醛（37%）和5 ml 10×电泳缓冲液，然后灌制凝胶，插入合适长度和宽度的梳子，于室温放置30分钟以上使凝胶凝固。

3. RNA样品处理（以一条泳道为例）一般取0.3 g的总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，65℃加热5 min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EB，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EB，这样电泳后的背景较低。配好的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15 min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30 min。

4. 加2.0 ml甲醛凝胶加样缓冲液（10×）

5. 加样和电泳

将凝胶预电泳15 min，电压降为5-10 v/cm。随后加样品和标准物，以3-4 v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。

五、注意事项

1. 每一泳道至多可分析30 mg RNA，通常用10-20 mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0 mg poly(A) RNA。

2. 标准物28S rRNA≥6333 base；18S rRNA≥2366 base；9S兔b珠蛋白mRNA≥710 base。溴酚蓝在前(≥300 bp)，二甲苯氰FF在后(≥4 kb)