细胞凋亡 WB 没成功，你是不是用了 RIPA？

细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程，通常表现为核浓缩，起皱，膜发泡以及 DNA 片段化。

WB 是研究细胞凋亡机理的基本方法之一，但是 WB 也不是谁都能做成功的，因为有可能你的第一步就做错了！用 WB 做细胞凋亡研究样品制备是第一步，样品制备方法至关重要否则会得到错误的结果和结论。

样品制备，看你是不是这样做的：

自配裂解液或者购买 RIPA，加上样品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后离心扔掉沉淀（RIPA 不可溶组分），取上清（RIPA 可溶组分）进行下游实验。

对对对！都是这么做啊，扔了取上清！

且慢，我们扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要紧，影响细胞凋亡的实验结果不？

例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.

Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase 的活性明显下降。

➤ 研究方法

1. 分别使用 RIPA 和 2%SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白

2. WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 检测

➤ 主要发现

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 缓冲液加超声处理可进一步从 RIPA 不可溶性组分中提取出蛋白。

例二．Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.

➤ 研究方法

1. MCF10A-5E 人乳腺上皮细胞激活 Fas 死亡受体，无激活组为对照

2. 分别用 NP-40（不含 SDS 和脱氧胆酸盐），RIPA buffer， Laemmil（SB）样品缓冲液提取蛋白

3. WB 进行 Clv-caspase-8 检测, Hsp90,Tubulin，P38 作为对照

➤ 主要发现

结果显示，仅在 Laemmil 缓冲液提取的样品中检测到激活形式的 Caspase-8，而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白样品中均未检测到。证明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱，某些特定蛋白会因刺激方式在可溶性和不可溶性组分之间移动。

例三．CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010

➤ 研究方法

1. MDA-MB231 细胞，分别用 shCon，shSnail 质粒转染，分别培养于普通培养基及 GD 培养基 12 小时

2. 使用 RIPA 提取蛋白，分别将 RIPA 可溶性组分和 RIPA 不可溶性组分进行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1，WB 检测。

➤ 主要发现

某些特定刺激诱导凋亡后，P53，caspase3，caspase9 等会聚集在 RIPA 不可溶组分中，不可溶性组分中 P53 和 caspase 9 信号甚至比可溶性组分中更强，表明目标蛋白在 RIPA 不可溶组分中显著丢失。证明 RIPA 并不能提取到真正意义上的总蛋白，丢掉的不可溶组分中还有很多蛋白，甚至是目标蛋白。

例四 .SU YEON LEE，et al（2010）.Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010

➤ 研究方法

1. MCF-7 细胞培养 4-9 天后，用 RIPA 分别进行蛋白提取，分为 RIPA 可溶性组分和不可溶性组分两组

2. SDS-PAGE 后，立春红染色（图 A），用 WB 分别检测 p53，CuZnSOD，MnSOD，Tubulin（图 B）

➤ 主要发现

MTS 培养过程中，RIPA 不可溶性组分中蛋白增加，可溶性组分和不可溶性组分蛋白图谱有很大差异，胞浆中的 CuZnSOD 和线粒体中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性组分中，而 p53 和 tubulin 则在 RIPA 可溶性和不可溶性组分中都存在。这表明，如果仅使用可溶性组分研究目标蛋白的定量，则结论可能是不准确或出现偏颇。

看了一圈下来，细胞凋亡 WB 没成功的原因，很可能就是因为你用了 RIPA！

RIPA 不适合做细胞凋亡 WB 检测的原因

1. RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。

2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱，目标蛋白及内参蛋白常常会丢失在被丢弃的不可溶组分中，仅使用可溶性组分研究不严谨。

3. RIPA buffer 提取的蛋白图谱偏差会得出错误或偏差结论，特别是涉及目标蛋白的定量问题时。

解决方案：

看了这些例证，是不是有点明白你凋亡研究 WB 为什么没成功了？主要是你的蛋白样品出现了问题，使用 RIPA

不严谨，必须要解决蛋白丢失，溶解度差，得到真正意义上完整的蛋白图谱。Invent 公司的柱式法蛋白提取试剂盒，可以帮你解决蛋白丢失问题，得到完整的蛋白图谱，是细胞凋亡研究的理想选择！