只因没选对它，WB、IF、IHC 统统都白搭....

2016 年 Nature 子刊建议的 5 种抗体验证方式，即是挑选抗体的金标准。

一、啥是 5 大验证?

5 大验证包含基因敲除敲弱验证、比较抗体验证、免疫捕获与质谱分析、生物特性与正交策略、蛋白过表达策略五项验证方式，说明如下：

1. 基因敲除敲弱验证

专业的来说，

敲除（Knockout）使用 CRISPR/Cas9 将目标基因从整个基因组里去除，使目标蛋白不表达，收取此 Knockout 细胞裂解液作为对照组，可确认抗体专一性。

敲弱（Knockdown）使用 siRNA 将目标基因静默，基因还在，但蛋白表达量降低甚至不表达。收取此 Knockdown 细胞裂解液作为对照组，可确认抗体专一性。

我给翻译翻译，就是取有表达蛋白的细胞裂解液，跟使用基因技术去除或减少蛋白的裂解液做比较，如果抗体专一性辨识蛋白，应该会出现一个样本有强条带，另一个样本弱（无）条带，如抗体无专一性则条带无变化

举个例子，癌症免疫常用的 PD-L1 抗体，下图可看到 GTX104763 PD-L1 抗体，使用基因敲弱的细胞裂解液，WB 的条带会随之变弱，显示 GTX104763 抗体具有高特异性。GTX104763 还适合多种应用，包括 WB、ICC/IF、IHC-P（可达 1:1,000）、 IHC-Fr（可达 1:1,000），及多篇文献引用，为高敏、高特异性的可靠抗体工具。

又如白血病标记物-CD44，CD44 参与介导细胞存活的迁移、增殖、分化和信号传导途径。GTX628895 CD44 抗体是小鼠单克隆抗体，使用基因敲除的细胞裂解液进行验证，可看到处理后条带消失，证实抗体特异性辨识 CD44 蛋白。GTX628895 还适用多种应用，包括 WB、IHC-P、FACS 和 IP，及多篇文献引用，为可靠的抗体工具。

2. 比较抗体验证

天下风云豪杰出，一入江湖天下知，刀剑交锋断柔情，青史惟有王者留。好抗体比了才知道，相同靶标、相同处理的样品，理论上抗体辨识的条带位置应该相同。如不相同，可能有其一抗体辨识错误蛋白或是其他原因；另外也可以通过比较找到更高敏的抗体。

以乳癌标记物-人表皮生长因子受体-2（HER2，也称 Neu 或 ERBB2）为例，临床上 Her2 的检测多采用免疫组织化学法检测其表达水平，也是决定要不要使用标靶治疗的依据之一。GTX100509 HER2/ERBB2 抗体使用 2 个不同来源的抗体进行比较（如下），确认有一致性的染色图谱，而 GTX100509 灵敏度甚至比其他厂家来的更高。

3. 免疫捕获及质谱分析

官兵抓强盗，敌友谁知道，预知此名号，捉拿验证号。将免疫捕获的目标蛋白进行质谱分析，可确认捕获的蛋白身份是否为目标蛋白，以此确认抗体是否辨识到对的蛋白。

例如：DNA 修复、基因稳定性及细胞凋亡研究常会使用的 PARP 抗体，GTX112864 PARP 抗体通过免疫捕获及质谱分析验证（PMID：30377371），并可进行 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、ChIP assay 等多种应用。

4. 生物特性与正交策略

做实验最怕该变不变，不该变却一直变，搞得跟朋友出游都不方便。生物特性与正交策略是指利用目标蛋白质本身的生物特性来验证抗体的专一性，包含：

a.

使用加药测试；

b.

以特殊条件处理细胞；

c.

使用已知具有蛋白高低表达量的样本作为阳性与阴性对照组；

d.

细胞定位；

e.

组织专一性。

例如，潜在胰脏癌标记物 Glypican-1 在许多人类恶性肿瘤表达中上调。GTX104557 Glypican-1 抗体使用多种细胞进行正交策略验证（如下图），且该抗体已通过 WB、ICC/IF、IHC-P、FACS、IP 和 ELISA 的全面验证。

另一个例子，胰脏癌标记物 KRAS。当 KRAS 基因突变，细胞分裂将不受控制，形成肿瘤。其中 KRAS G12D 和 G12V 突变占这些变化的 75% 成为研究的热点。在市面上有许多 KRAS G12D 的抗体，选择抗体时可优先挑选经过验证的，如有组织染色的结果更佳，像是 GeneTex 的兔单抗 GTX635362。GTX635362 RAS（G12D 突变体）抗体通过使用多种细胞及正常与癌组织对照进行正交策略验证；在人胰腺癌细胞系和 PDAC 小鼠模型的 RAS G12D 突变蛋白表现出高度的敏感性和特异性。左图为印迹（WB）和右图为免疫组化（IHC-P）。

5. 蛋白过表达

利用在细胞中过表达目标蛋白，并收取细胞裂解液后进行 WB 分析，理论上蛋白量增多，抗体辨识后的信号也会增强，因此可确认抗体是否特异性辨认正确蛋白。

举例来说，表观遗传学重要蛋白 TET1，一般在细胞内的表达量较低, 蛋白生命周期也短, 往往不易侦测。这时可进一步使用过表达 TET1 的细胞裂解液作对照（下图 B），可看到抗体辨识的条带会明显增强，确定抗体辨识具有特异性。

另一个例子，黑色素瘤标记物-S100B 是钙结合蛋白，主要在中枢神经细胞表达，特别是星形胶质细胞。在黑色素瘤细胞和其他一些组织也发现 S100B 表达。为黑色素瘤的独立预后标志物。GeneTex 的 S100 beta antibody（GTX129573）通过过表达验证如下图，过表达的细胞裂解液出现明显条带（下图 B）。GTX129573 也可应用在 WB、ICC/IF、IHC-P、IHC-Fr 实验，为高敏及高特异性抗体。

二、五项验证要同时通过吗?

五项验证要同时通过是非常困难的，主要受限于技术与材料，大部分的抗体验证仅能通过 1~2 项的验证，能同时通过 5 项验证可说是少之又少，例如，免疫及肿瘤研究常会使用 GTX107678 NFkB p65 抗体就是少数的例子之一。GTX107678 NFkB p65 抗体通过 5 项验证方法，并且全面验证 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、EMSA，是目前唯一一个能同时通过 5 种验证的 NFkB p65 抗体。

另外还有 GTX628887 EGFR 抗体跟 GTX112864 PARP 抗体也是少数同时通过 5 种验证的例子。

三、总结

挑选通过基因敲除敲弱、比较抗体、免疫捕获及质谱分析、生物特性与正交策略和蛋白过表达 5 大验证的抗体，有助于实验不走弯路，降低失败率，更快完成实验，早早回家将不再是梦想喔。