苏木素-伊红染色法（HE染色法）检测细胞凋亡

苏木素-伊红染色法（HE染色法）检测细胞凋亡

凋亡检测中形态学方法是最直观、可靠的方法之一。对组织和各种细胞进行染色后，在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察，通过观察细胞的形态或染色的类型来判断凋亡的发生与否。

【材料及试剂】

（1）苏木素液：先将2.5g苏木素溶于25.0ml乙醇中，再将预先已溶有2.5g明矾的蒸馏水500ml加入苏木素乙醇溶液中，煮沸后将火焰熄灭，慢慢加入1.25g氧化汞，防止溶液溅出，再煮沸2min，将容器立即浸入冷水中，当溶液冷却后，加入20ml醋酸，室温保存，用前过滤。

（2）伊红染色液：取蒸馏水 75ml，先将少许蒸馏水加入0.5～1.0g伊红，用碾棒将伊红碾碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入95%乙醇25ml，最后滴入醋酸1～2滴。

（3）盐酸乙醇分化液：盐酸0.5ml，75%乙醇100ml。

（4）二甲苯，100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，75%乙醇，蒸馏水。

（5）甲醇，苦味酸，中性树胶。

（6）组织切片机，离心机，光学显微镜，离心涂片机。

【操作方法】

1、石蜡切片的HE染色

取一组织块，经甲醛或苦味酸固定24小时后，常规石蜡包埋，4um切片；

按以下方法脱蜡：二甲苯（I）5min，二甲苯（II）5min，100%乙醇2min，95乙醇1min ，80%乙醇1min，75%乙醇1min，蒸馏水洗2min；

苏木素染色5min，用流水冲洗；

盐酸乙醇分化30秒；

自来水浸泡15min；

伊红染色2min

脱水，透明及封片按以下步骤：95%乙醇（I）1min，95%乙醇（II）1min，100%乙醇（I）1min，100%乙醇（II）1min，二甲苯石碳酸（3∶1）1min，二甲苯（I）1min， 二甲苯（II）1min，中性树胶封片；

2、细胞涂片或细胞甩片的HE染色

细胞涂片或细胞甩片的制备：对于贴壁细胞，可将盖玻片放于培养器皿中，让培养细胞长于玻片上，然后用药物诱导细胞凋亡后取出，用4%多聚甲醛固定5min。对于悬浮细胞，用药物诱导细胞凋亡后，离心1000r/min收集细胞，用PBS洗2次，收集调整细胞数为1X105 /ml，涂片或用离心甩片，用4%多聚甲醛固定5min；

染色与石蜡切片HE染色（3）～（7）相同；

【结果判断】

在光学显微镜下，贴壁细胞由原来的梭形或多角形变小、变圆，核呈蓝色或蓝黑色，胞浆呈淡红色，核固缩、破碎，形成凋亡小体等。悬浮细胞，整个细胞皱缩，核固缩，破碎，形成凋亡小体，染色质颜色加深等。

3、冰冻切片的HE染色

冰冻切片的制备：取一小块固体CO2 至密闭的金属容器丙酮中，直至气泡冒完为止，将组织切割成小块，投入冰冻液中，然后切成5μm，空气中干燥，于-70℃可保存3个月；

染色与石蜡切片HE染色（3）～（7）相同；

【结果判断】

光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，核染色质致密浓缩，核固缩，核破碎，形成凋亡小体等。