从免疫印迹到抗体纯化

一、材料和试剂

1. PVDF或硝酸纤维素膜（Amersham，GEhealthcare）

2. 透析袋（PierceCat#68035）

3. 丽春红S（Sigma，Cat#P7170）

4. 脱脂奶粉（Carnation，any your favorite brand in local store）

5. 吐温-20（Sigma）

二、步骤

1. 取1-10 mg 纯化的抗体进行合适的SDS-PAGE。注：大量的抗原蛋白对于高纯高产的抗体是关键的。尽可能多得上蛋白样。

（1）用大的梳孔（产家一般制作梳子仅有2个孔：一个正常大小用于上标记（marker），另一个占了剩下的空间）。

（2）不溶蛋白可以在变性条件下纯化。

（3）甚至是水溶蛋白，用上样缓冲液纯化也可得到大量产物。注：如果你的蛋白带有大的标签如GST，MBP，NusA等，需要用这些标签蛋白做杂交来预清除血清中这些标签的抗体。

2. 转移到PVDF或硝酸纤维素膜。注：如果蛋白分子量小，选择0.2 μm 孔径而不是45 μm。

3. 用丽春红S溶液将膜染色并尽可能小的剪下含有抗原蛋白的条带。

4. 用100 mM pH2.5的甘氨酸预洗膜10 min，用TBST洗。

5. 室温下用5%溶于TBST中的脱脂奶粉中封闭1 hr。

6. 用TBST洗3次。

7. 5-10 ml 抗血清4°C过夜封闭。主要根据膜的尺寸。

8. 用TBST洗3次。

9. 用1-2 ml 100 mM 甘氨酸（pH2.5）孵育膜2 min，以洗脱抗体。

10. 孵育时，加入75 μl-100 μl 2 M Tris·HCl（pH8.5）到管中。加入的体积应使步骤11中管里的终浓度是150。

11. 2 min 后，将1-2 ml 洗脱的含抗体的甘氨酸从步骤9的管中加到步骤10中的管子。Tris pH8.5将被酸性的甘氨酸中和。

12. 重复9-11步3次。

13. 在PBS pH=7.4条件下透析碎片并确定常规蛋白实验使用的抗体浓度。

14. 用免疫印迹，免疫沉淀，免疫荧光染色等方法检测抗体。