从免疫印迹到抗体纯化
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一、材料和试剂
1. PVDF或硝酸纤维素膜(Amersham,GEhealthcare)
2. 透析袋(PierceCat#68035)
3. 丽春红S(Sigma,Cat#P7170)
4. 脱脂奶粉(Carnation,any your favorite brand in local store)
5. 吐温-20(Sigma)
二、步骤
1. 取1-10 mg 纯化的抗体进行合适的SDS-PAGE。注:大量的抗原蛋白对于高纯高产的抗体是关键的。尽可能多得上蛋白样。
(1)用大的梳孔(产家一般制作梳子仅有2个孔:一个正常大小用于上标记(marker),另一个占了剩下的空间)。
(2)不溶蛋白可以在变性条件下纯化。
(3)甚至是水溶蛋白,用上样缓冲液纯化也可得到大量产物。注:如果你的蛋白带有大的标签如GST,MBP,NusA等,需要用这些标签蛋白做杂交来预清除血清中这些标签的抗体。
2. 转移到PVDF或硝酸纤维素膜。注:如果蛋白分子量小,选择0.2 μm 孔径而不是45 μm。
3. 用丽春红S溶液将膜染色并尽可能小的剪下含有抗原蛋白的条带。
4. 用100 mM pH2.5的甘氨酸预洗膜10 min,用TBST洗。
5. 室温下用5%溶于TBST中的脱脂奶粉中封闭1 hr。
6. 用TBST洗3次。
7. 5-10 ml 抗血清4°C过夜封闭。主要根据膜的尺寸。
8. 用TBST洗3次。
9. 用1-2 ml 100 mM 甘氨酸(pH2.5)孵育膜2 min,以洗脱抗体。
10. 孵育时,加入75 μl-100 μl 2 M Tris·HCl(pH8.5)到管中。加入的体积应使步骤11中管里的终浓度是150。
11. 2 min 后,将1-2 ml 洗脱的含抗体的甘氨酸从步骤9的管中加到步骤10中的管子。Tris pH8.5将被酸性的甘氨酸中和。
12. 重复9-11步3次。
13. 在PBS pH=7.4条件下透析碎片并确定常规蛋白实验使用的抗体浓度。
14. 用免疫印迹,免疫沉淀,免疫荧光染色等方法检测抗体。