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免疫印迹分析

相关实验:非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验

最新修订时间:

材料与仪器

蛋白质样品
钒酸钠 封阻液 TN TNA Tris·Cl 叠氮钠 印度墨汁染色液 TBS
吸水纸 水浴锅

步骤

1.  用等体积的2×SDS上样缓冲液溶解培养细胞,组织或裂解物,煮沸5 min。
 
2.  在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳样品,用含100 μmol/l 钒酸钠的转移缓冲液将蛋白质转移至适用于免疫印迹分析的膜上。

3.  膜在室温下用30~50 ml 封阻液封闭30 min 以上。
 
4.  在带盖的塑料容器内,膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体溶液室温温育60~120 min,间或摇动。
 
5.  取出膜,用吸水纸吸干多余液体,在一个新的塑料容器内,用TBSA溶液洗膜 2次,每次10 min;50 ml NP-40洗膜液洗膜2次,每次10 min;再用50 ml TBSA洗膜2次,每次5 min,弃洗液。
 
6.  用30~50 ml 含0.5 μCi/ml 125I 标记蛋白A与膜在室温下温育60 min,间或摇动。

7.  移出膜,用吸水纸吸干多余液体,同步骤5洗膜。 
 
8.  如果需要,用30~50 ml 墨汁染色液染膜5~10 min,直到有可见蛋白带,充分洗膜除掉多余的墨计。
 
9.  用吸水纸吸干多余液体,用塑料包装膜包好,加上放射性或荧光的位置标记后,用经预闪光致敏的X光片和增感屏,自显影18 h至10天。

来源:丁香实验

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