非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

鉴定蛋白质中磷酸化的氨基酸残基是很有意义的。磷酸化作用发生在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酩氨酸时，通过部分的HCl水解及接着进行双向薄层电泳，可以便利地鉴定标记的磷酸氨基酸。

来源：丁香实验

操作方法

免疫印迹分析

1. 用等体积的2×SDS上样缓冲液溶解培养细胞，组织或裂解物，煮沸5 min。 2. 在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳样品，用含100 μmol/l钒酸钠的转移缓冲液将蛋白质转移至适用于免疫印迹分析的膜上。 3. 膜在室温下用30~50 ml 封阻液封闭30 min 以上。 4. 在带盖的塑料容器内，膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体溶液室温温育60~120 mi

化学发光法

1. 如基本方案步骤1所述，用SDS-聚丙烯醜胺凝胶电泳分离样品，使用含100 μmol/l 钒酸钠的转移液将蛋白质转印至硝酸纤维素滤膜上。 2. 在塑料容器内，膜与不含叠氮钠的封阻液在室温温育至少30 min。 3. 室温下膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体温育60~120 min，间或摇动。 4. 在一干净的塑料容器内，用TN缓冲液冼膜2次，每次10 min；用含0