化学发光法（非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验）

1. 如基本方案步骤1所述，用SDS-聚丙烯醜胺凝胶电泳分离样品，使用含100 μmol/l 钒酸钠的转移液将蛋白质转印至硝酸纤维素滤膜上。

2. 在塑料容器内，膜与不含叠氮钠的封阻液在室温温育至少30 min。

3. 室温下膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体温育60~120 min，间或摇动。

4. 在一干净的塑料容器内，用TN缓冲液冼膜2次，每次10 min；用含0.05%NP-40的TN缓冲液洗膜2次；毎次10 min 再用TN缓冲液洗膜2次，毎次5 min 弃冼液。

5. 加入30~50 ml 针对第一抗体的过氧化物酶偶联的第二抗体，室温温育60 min，间或摇动。

6. 如步骤4所述洗膜。

7. 在比膜稍大的塑料容器内，等体积混合用于ECL检测的鲁米诺试剂和氧化剂。

8. 将膜（含蛋白质样品的一面朝上）浸入混合试剂，轻摇60 s。

9. 取出膜，沥干多余液体，置于塑料保护膜内，蛋白质朝上。

10. 在暗室内对X光片曝光15 s~30 min。