增强化学发光法(ECL)

Ecl 显色原理：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

试验步骤：

1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。

2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体）

1. 如果WB前没有可参考的资料--比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；

2. 去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1-2倍的量）；如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。

3. 对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD-20KD间的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法）

4. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。

5. 膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了。

6. 电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。

7. 半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系。半干转可以在30分钟内完成转膜（每平方厘米电流2.5-3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60-90分钟，但要防止过热。如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照单个计算），只要控制好单位面积的电流强度，防止过热就好了。

8. 有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。

9. 如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。

10. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并说预电泳6小时（有还原剂如Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。

11. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。

转膜后的封闭注意：

12. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方，用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素-亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。

经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记：封闭时间和封闭剂的量都要足够。

13. 如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。