关于免疫印迹实验的相关问题

注意一下跑胶时候的电压以及时间，跑的时候经常看着点。转膜的时候记得缓冲液新配置

跑胶过程中，可以考虑低压低温，就是采用低电压，电泳槽放在冰水中。转膜过程也可以考虑这样处理。后续的孵育可以在低温（4度)下延长孵育时间。

有可能样本没有处理好，我以前出现过这种情况

这个跟很多因素相关，比如跑电泳时电压的大小，转膜是否充分，抗体的问题

1.制胶：

先制分离胶，再制浓缩胶，严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀！混匀！混匀！个人经验是每加一种试剂，就混匀一下，直到最后一种试剂加完。

对于初学者，还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的，两者需要的制胶液体量是不一样的。另外，玻璃板一定要洗干净，本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗，再放在烤箱里烤干并晾至室温。

2.点样：

点样的过程很简单，表手抖就 OK 了。再者，点样的过程一定迅速，不然前面的样容易弥散，虽说不至于太影响结果，但对于有强迫症的同学来说还是比较致命的伤害。

3.跑胶：

注意，跑胶时也会出现各种乌龙，如果跑了好大一会儿还不见条带下移，请看一下你的玻璃板是否放反；如果跑胶时发现温度过高，可检查一下正负极是否连接反了。跑胶建议恒压，80V 30min， 120V 60min（这个得具体看目的条带的 位置，时间可相应增减）

4.转膜：

请牢记转膜顺序（黑色面-滤纸-海绵-胶-膜-海绵-滤纸-白色面），如若搞不清楚，可想象一下，蛋白质是带负电荷的，应该是往正极方面跑，所以膜应该放在正极面。转膜时要恒流， 285mA—300mA 60min。特别注意的是跑胶时恒压，转膜时恒流这个条件。

5.封闭特异性抗原：

封闭和孵育抗体也是非常关键的步骤，封闭建议大家用 5%的脱脂奶粉， 2 个小时（或者过夜），不建议用 BSA。

6.一抗孵育：

封闭完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封闭和抗体孵育用的蛋白，封闭用牛奶，抗体孵育用 BSA，这个条件是决定条带是否齐整及有无杂带的关键），过夜（或 2 个小时）。时间上与封闭错开，如若封闭过夜，则一抗只需要两个小时。

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小时，洗的时间很重要，习惯是洗三遍，第一二三次分别是 5min、10min、15min。还要特别强调的是，孵育和洗膜用的转速是不一样的。孵育是低速，使膜和抗体有充分的接触时间；洗膜时要用高速，以使膜洗得干净。还有，一抗孵育时正面朝下，封闭和二抗孵育时都是朝上。（表问为什么，不知道，经验之谈）

8.曝光：

当满足了所有以上的实验条件之后，你就可以自信满满地去曝光了。相信我，不管是磷酸化的还是普通的蛋白，都会出现平整光滑的条带。

转膜的时候注意降温，防止胶变形。

WB的注意事项：

蛋白质的提取

▶ 提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。

▶ 蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。

▶ 蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

提高跑胶质量的Tips

▶ 小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。

▶ 胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。

内参的选择

▶ 做全细胞和细胞质的WB实验时，选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时，由于Histone H3是染色体的组成型表达组分，表达相当稳定，并且特别好跑，可以算是细胞核内参的首选。

▶ 针对一些特定的内参，蛋白上样量超过一定的量时，出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin，当上样量超过20 μg时，条带灰度不会呈线性的增加。因此，在做WB校正时，调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。