免疫印迹实验相关原理介绍

免疫印迹(Western blot)简介和原理

免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原（一般为蛋白质）并测定抗原的大小。蛋白质首先通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射，生色或化学发光的方法进行定位。

实验常规试剂

1. 1.0 mol/L Tris•HCl（pH6.8）
2. 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）
3. 10% SDS
4. 10% 过硫酸胺（APS）
5. 还原型 5XSDS 上样缓冲液
6. 10X 电泳液缓冲液
7. 10X 转膜缓冲液
8. 1X 转膜缓冲液
9. 10XTBS 缓冲液
10. 1XTBST 缓冲液
11. 封闭缓冲液: 1X TBST含5% w/v 脱脂牛奶或者 1X TBST 含 2%-5% 的牛血清白蛋白(BSA)。

操作步骤

1. 根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度制胶
2. 上样使用适当的裂解液以及裂解方法裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品。
3. 跑胶：浓缩胶推荐用 80 伏电压，待样品进入分离胶后，可用 120-180 伏电压。
4. 跑胶完成以后，需先将胶上无样品的多余部分切除，滤纸和海绵需要预先润湿。
5. 分离的蛋白转移至膜载体上

选择合适的膜

转膜：以 NC 膜为例

提前十分钟到半小时用转膜 Buffer 润洗 NC 膜

按照以下的结构来安装转膜体系：负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵-正极。

1. 转膜，一般为 2 小时。
2. 转完后将膜用1×丽春红染液染 5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
3. 抗原检测

免疫印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭：

1. 转好的膜先用 TBST 润洗两次，每次五分钟。低速水平摇床，常温。
2. 用 5% 的脱脂牛奶（TBST 配制）常温封闭一至两小时。封闭过程应在常温下置于转速较低的水平摇床。

抗体与抗原特异性结合：一抗孵育

9-11.用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

1. 常温下用二抗孵育一到两个小时。

13-15. 用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

1. 准备 ECL 底物，对 8×5 cm 的膜，2 毫升（1 毫升 A 加1 毫升 B）足够。将膜浸润底物中 1 分钟，然后取出，用滤纸吸掉膜上多余的底物。
2. 用 x-ray 底片曝光，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1 min 或 5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

Western blot 常见问题分析指南

为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确；适当降低电泳时的电压；

为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。