免疫印迹-抗体的纯化和鉴定实验

(1) 按照前面叙述的进行 SDS-P A G E 电泳。将包括目标分子的还原和非还原样本上样于凝胶。电泳进行结束后，取下夹住胶的两块玻璃板中的一块，将胶剪一个角进行加样定向。

(2) 用塑料盘内的去离子水轻洗凝胶。倒掉水并加转移缓冲液。孵育凝胶 30m in。
(3) 剪一张与凝胶同样大小的硝酸纤维纸及两张滤纸。

(4) 在另一个塑料盘内加人转移缓冲液。将凝胶、3 张滤纸、两块吸水海绵垫放置在含有转移缓冲液的盘中。浸 泡 2〜3m in。

(5) 按照生产商的说明准备免疫印迹装置，将电极插人缓冲电泳槽中，在电泳槽的底部放置一个 I i n 的搅拌棒。

(6) 打开凝胶夹，按照下列顺序将海绵，凝胶及滤纸放在凝胶夹的黑色表面上：海绵一滤纸一凝胶一硝酸纤维素膜一滤纸一海绵。确保凝胶面与硝酸纤维素纸相对且在两者之间不能有气泡。闭合此转移夹。

(7) 在印迹装置中加人约 400ml 的转移缓冲液。插人凝胶夹，使其黑面对着电泳槽的黑面。插人冷却装置。

(8) 将电泳槽放在磁力搅拌器上并打开搅拌器使其低速搅拌。盖上电泳槽盖。按正确的电极接通电源导线。

(9) 打开电源使系统，设置电压为 100V 。开始时电流应约为 250m A ，转印快结束时约 为 350m A ，转 印 约 l h 。

(10) 转印结束后，拿出转印夹，轻轻将转印膜放到一个盛有洗涤缓冲液的塑料盒内，漂洗膜① 3 次, 每次约 5min。

(11) 于 10 ml 封闭缓冲液中孵育膜 30min。如果必要可封闭过夜。封闭 后 ，在洗涤缓冲液中漂洗凝胶 3 次 ，每 次 约 5m in。

(12) 按照下面的描述用封闭缓冲液稀释抗体来准备一抗：

(13) 纯化的抗体最好用 0. 5〜1.0g/m l。

(14) 抗血清最好按 1 : 200〜1 : 5000 稀释。

(15) 腹水最好按 1 : 500〜 1: 10000稀释。(16) 含有单克隆抗体的细胞培养，最好不稀释或者按1： 10〜1: 100 稀释。

(16) 含有单克隆抗体的细胞培养，最好不稀释或者按1：10〜 1 : 100 稀释

(17) 准备足量的抗体稀释液以覆盖塑料盒中的膜，需 15〜20ml。将稀释好的抗体倒在塑料盒中的膜上。将其放在在水平摇床上孵育 30min。将摇床设置为低速。

(18) 孵育后，用洗涤缓冲液漂洗凝胶 3 次 ，每 次 5min。

(19) 准 备 HRP-交联的二抗。根据来源，按照供应商的建议进行稀释。抗体应该在洗涤液中按 1 : 500〜 1 : 10 000 稀释。如果浓度过高，有可能发生背景问题，如果浓度过低 ，可能不能显示含量低的弱条带。

(20) 将 稀 释 HRP-交联的二抗加到膜的塑料盒内。将其再次放置于水平摇床上孵育30m in。孵育后，用洗涤缓冲液漂洗膜 3 次 ，每 次 5min。

(21) 轻轻倒出最后的洗涤液后，加 T M B 膜底物。孵 育 2〜10 m in。淡蓝色的条带开始显现出来，此处是特异性抗体-抗原复合物形成的位置。

(22) 倒掉酶底物溶液并加人去离子水以终止反应。扫描膜并储存任何有用的结果。例如，扫描结果可以数码形式保存; 膜可以进行真空干燥并将其密封在袋里, 保存于4℃