【原创】LAMP实验降低污染方法心得

做LAMP实验有一年多的时间了，其间共做了3个关于LAMP的课题，目前为止基本没有污染~尤其是自己的毕业论文，用完了500uL的 FIP，全部开盖跑电涌，没有一次污染。

今天为止做完了所有毕业实验，坐下来总结一下自己的心得~~我只是个小硕士生~~所以都是在浅显的方面叙述，希望大家不要鄙视~~

首先感谢一下LAMP交流群，没有这么多老师和同伴在，我不可能顺利毕业。比较可惜的是群里现在人满了。

下面开始正文~~

1. 引物

我一共用过8组引物，所有课题加起来。primerexplorer的引物有效性最高。

引物中有的因为敏感度低被淘汰，有的因为特异性不好被淘汰。

我的经验是，如果一组引物试了几次不出结果。排除其他试剂活性或者DNA的原因，就要果断换引物。如果一组引物是有效的。那它在所有相似配合比的反应液下，都会出结果的。

一对引物设计出来之后，我先会用BLAST检测它的特异性。但是收到引物之后，你需要自己用实验来验证它的Tm值和特异性。。。跟你预想的可能会很不一样~~

2. 操作

污染几乎是所有LAMP工作者都会遇到的问题。也都知道要小心操作。但还是很少有人能避免~ 我说一下我的操作方法

提取DNA过程：如果用DNA Kit或者用试剂提取，在跑电泳的房间操作的话，70%会被污染。如果是直接煮10分钟后使用，基本不会污染。

配试剂过程：-70度冰箱在自己实验室里, 所以没办法, 试剂只能放在这. 但是用隔离比较好的小盒子, 里面只放primer, polymerase, buffer, 和你实验需要的其他试剂如甜菜碱等..

我们实验室相隔10米有一件系共同实验室. 我在共同实验室里面找了个空抽屉, 放PCRtube, DEPC water, filter tip， EP tube，手套，等等消耗品，分小盒子装好。如果有条件，放一套pipette...我是每次做实验之前去别的房借着用每次做实验的时候，先把放试剂的小盒子拿到共同实验室，开始配试剂。

配好试剂分装好之后，把试剂盒整理一下拿回实验室，顺便把DNA样本（另一个盒子，或者试管架之类的）拿到做实验的地方。然后把DNA样本放进试剂里面去。最后该拿回来的拿回来。该留在共同实验室的留在那。

需要特别说明的一点，许多同学都把PCR tube和 tip 又用DEPC泡，又反复灭菌的。我觉得没什么必要。我只是在最开始做实验之前，屯一大堆消耗品在共同实验室。有的甚至灭菌都懒得做了，直接拆开包装袋的拿来用。都没有污染过。

反应进行过程： 我是用的PCR机器。。不是我毕业论文的另一个课题，开始有污染的情况。但是污染的很怪异。因为我之前做毕业论文实验的时候，没有过污染，所以很大意的一直用8个连着的PCR tube，省事不是嘛。

但是后来的这个课题，污染的情况是，先是8个连着的tube做LAMP，全都污染了，条带深度都一致的。但是一起配的试剂，分两次做的LAMP反应，后来的就完全没有污染。

对这个问题，经过群里的某位老师指点，因为PCR机器加热的部分不一样，在加热的过程中，PCR tube的盖子有可能有轻微弹开的情况。连着的tube，就都弹开了，所以互相污染了。总结一下，第一是实验中尽可能的用单个的PCR tube，第二是用PCR机器的话，机器盖子一定要扣紧。之后实验再也没污染过~~

3. Kit

我买过一次日本原装的Kit，没有变色也没有条带。不知道是不是正好我买的试剂出现了次品。只买过一次，所以对Kit本身还是不做评论了。
不过不用Kit，自己配试剂结果很好，所以。

4. 酶切反应

LAMP的酶切正常情况下对单一酶切位点的酶，处理之后会出现3种长度的条带。酶切条带的长度在我看过的论文上从来没出现过。只有一篇论文展示了酶切电泳图，但是没有写明长度。我的实验中酶切算法参照了蓝谱的网页。比较麻烦，有兴趣的可以跟我联系~

5. 参考文献

不知道为什么，有的参考文献设计的实验很不靠谱，根本不合逻辑，或者说没有阴性对照，或者看起来跟污染一样，但是却声称是自己的检出限度非常敏感。。。很不赞同这种糊弄过去就发表一篇论文的做法。希望大家都细心操作，写出高信赖度的好论文~~~~piapia