【心得】LAMP引物设备 一看就会

LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：
首先单击浏览钮择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于2 2 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面个项中择定参数设定（引物设计条件条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。

设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计LAMP反应的引物。
　　在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：
1.引物之间的距离
　　F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。
2.引物的Trn值
　　引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration),寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
　　例如：寡核苷酸的浓度为0.1?mol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。
　　Tm(退火温度=△undefined1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+]
　　式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1. 987ca1/℃?rnol ； △H为焓变；△s 为熵变；C为寡聚核苷酸的浓度；[Na+]为钠离子浓度。
　　对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60~65℃，而对于AT富集的引物Tm值为}55~60℃。在设计引物的时候，F1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃), F2,B2, B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。
3.引物末端的稳定性
　　引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性，自由能改变值(△G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差，反应朝着自由能减小的方向运行口引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应，自由能改变值(△G)越小，引物与模板之间的退火反应越容易发生。
　　一般在进行引物设计的时候，F2/B2\F3/B3的3’端和F1 c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5’端扩增以后相当于F1的3’端，所以它的稳定性很重要。
4 GC含量
　　引物在设计的时候使其GC含量介于40%~65%之间，但是当引物的GC含量介于50%~60%时，引物的质量相对好一些。
5.二级结构
　　引物在设计的时候要防止形成二级结构，这一点是十分重要的，特别是内引物。