【心得】引物设计其实很简单,敢于尝试就会成功
丁香园论坛
3016
因为有热心战友的不断提问,“【心得】引物设计其实很简单,敢于尝试就会成功”就增加到三贴了,我把它们合并一下,方便战友指正吧!
第一贴
记得当时搞引物设计的时候,还是我的大师兄领入门的,在此谢过了。师兄教了一些基本原则后,就放羊了。接着自己捣鼓来捣鼓去,在导师的实验室内设计了十几条引物,用起来还蛮好的,逐渐赚了点名气。后来,就和上海鼎安合作了,帮别人设计引物在他们公司订购引物,拿点回扣。别人拿给我设计的引物,都是很头痛。因为客户往往都是自己捣鼓一下,不行了才到我这。到现在已经成功设计了四五十对引物了。不过至今money颗粒无收,就不了了之,主要是客户拖欠的问题,不过不后悔,毕竟是不错的经历啊。所以,也算是有点个人观点,和大家分享,不对的地方请指正。
我用Primer 5.0搜索引物、Oligo 6.0评估引物,这是根据各自所长定的。但有个朋友,他就只用Oligo,说设计的引物也还可以。
Primer 5.0搜索引物:
1.Primer Length我常设置在18-30bp,短了特异性不好,长了没有必要。当然有特殊要求的除外,如加个酶切位点什么的。
2.PCR Product size最好是100-500bp之间,小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来,条带很模糊,不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
3.Search parameters还是选Manual吧,Search stringency应选High,GC含量一般是40-60%。其它参数默认就可以了。
4.搜索出来的引物,按Rating排序,逐个送Oligo软件里评估。当然,搜索出的引物,其扩增产物很短,你可以不选择它,或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C,这样的引物应作为次选,没得选了就选它。对于这样的引物,如果其它各项指标还可以,我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基,看看引物的评估参数有没有变好点。
Oligo 6.0评估引物:
1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间,The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关,我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候,The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
2.Hairpin Formation根据黄金法则
3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右,更多当然更好。
4.在PCR栏,个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候,退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
5.Internal stability很重要:我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形,最起码保证3端不要过于稳定。 下图1引物3端过于稳定,很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则,这其实很好理解:把一滴水放到大海里,这滴水就会不停的扩散分布,扩散的越厉害越稳定,所以△G绝对值越大结构越稳定。
最后说一句,敢于尝试就会成功。
第二贴
--科室工作很多,小医生了,没有办法,所以肯怕不能满足很多战友的要求(qq聊或帮助设计),在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下,不一定正确,供参考吧。
--1、两个评价系统不一样,个人感觉oligo评价引物好点,primer出来的引物,我一般按效率排序,再结合退火温度和引物长度,选择引物到oligo测试。这是初步的选择,其实引物到了oligo里,退火温度也不一样。
--2、3端的二聚体应该避免,这个要看你的退火温度决定,一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了,一般来讲尽量控制在-4.5kcal/mol以下(个人观点,很多东西真得还是需要自己摸索)。
--3、个人感觉3端有A无A影响不大,3端有T的没有经验。有T是不是一定不行,个人感觉不见得。软件是评估,法则也不是没有例外,不是1+1=2那么确定。
--4、错配和二聚体谁轻谁重,个人觉得“到致命的程度”谁都重要,我也说不好。我设计的时候,尽量两个都不得罪。
--5、GC含量并非不重要,它直接影响引物各端稳定性,3端来两个G或C,稳定性就上去了,粘在模板上很牢。所以我设计的时候,尽量避免这样的情况出现。
谈一下我学这个引物设计的过程吧:
入门--前面我说过是我的大师兄把我领进门的,之后我就自己捣鼓。一开始严格按照引物设计的黄金法则来,primer搜出来的引物oligo评估,我就这样一条引物一条引物地反复评估,不厌其烦,到处查阅资料,一做就是几个小时,幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。
提高--有了成功的经验后,就继续做,当时我们实验室要定很多引物,我就有了练手的素材,这也很重要--什么东西不是练出来?!设计多了,问题也多了。有些引物按黄金法则来,行不通了,怎么办?
1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基,再反复评估
2、有些引物还不行,我就把5端突变一个碱基,再反复评估
3、再不行,我就放宽条件。放宽到什么样可以,不好说,自己摸索。有的 一对引物,其中一条错配很厉害,而另一条很可以,在没有其它选择的情况下为什么不可以。
有的人担心,这不一定跑的出来啊。对自己要有信心啊,原因有二:1.自己的引物谁有功夫帮你设计?所以啊,当时我就被“赶鸭子上架了”,反反复复搜索评估的基础上,出来的应该是目前最好的;2、还有,我经常看国外文章的引物,有的评估起来表面上差的要命,人家照用,结果还不是出来了。我就分析这样的引物,得出经验,胆子也大了。当然失败肯定是有一两次的。当然,有人说我就设计那么一条引物,输不起。那只好说Sorry了!
总之,我的经验就是:立即上手,遇到问题再解决问题,不厌其烦,不就是个软件嘛,还征服不了?!
第三贴
楼主说得很对,设计引物的最后一步就是验证引物的特异性,我有一贴就是说引物验证的,在此不赘述,见下:
鉴于BLAST界面已改变,本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11865624&sty=1&tpg=1&age=0
注:个人感觉一对引物设计出来,即使不做blast,非特异性引发的可能性也不是很大,当然这一步在设计引物里是不可省略的。怎样增加blast检测中非特异性引发的可能性,我想也许可以增加expect值(见教程参数设置),给它设置成2000、3000、5000.....。老版本,原来有个short片断 blast的,可以用来验证引物,里面Expect(期望值)默认是1000,我试过5000,没有看出有什么可观的改变,所以1000够了。我猜想,Expect值增大,"非特异性引发的可能性"能够更好地被检测出,感兴趣的战友可以试试。
申明:个人意见,或对或错,有兴趣的战友可以自己测试一下
图1
第一贴
记得当时搞引物设计的时候,还是我的大师兄领入门的,在此谢过了。师兄教了一些基本原则后,就放羊了。接着自己捣鼓来捣鼓去,在导师的实验室内设计了十几条引物,用起来还蛮好的,逐渐赚了点名气。后来,就和上海鼎安合作了,帮别人设计引物在他们公司订购引物,拿点回扣。别人拿给我设计的引物,都是很头痛。因为客户往往都是自己捣鼓一下,不行了才到我这。到现在已经成功设计了四五十对引物了。不过至今money颗粒无收,就不了了之,主要是客户拖欠的问题,不过不后悔,毕竟是不错的经历啊。所以,也算是有点个人观点,和大家分享,不对的地方请指正。
我用Primer 5.0搜索引物、Oligo 6.0评估引物,这是根据各自所长定的。但有个朋友,他就只用Oligo,说设计的引物也还可以。
Primer 5.0搜索引物:
1.Primer Length我常设置在18-30bp,短了特异性不好,长了没有必要。当然有特殊要求的除外,如加个酶切位点什么的。
2.PCR Product size最好是100-500bp之间,小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来,条带很模糊,不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
3.Search parameters还是选Manual吧,Search stringency应选High,GC含量一般是40-60%。其它参数默认就可以了。
4.搜索出来的引物,按Rating排序,逐个送Oligo软件里评估。当然,搜索出的引物,其扩增产物很短,你可以不选择它,或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C,这样的引物应作为次选,没得选了就选它。对于这样的引物,如果其它各项指标还可以,我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基,看看引物的评估参数有没有变好点。
Oligo 6.0评估引物:
1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间,The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关,我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候,The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
2.Hairpin Formation根据黄金法则
3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右,更多当然更好。
4.在PCR栏,个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候,退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
5.Internal stability很重要:我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形,最起码保证3端不要过于稳定。 下图1引物3端过于稳定,很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则,这其实很好理解:把一滴水放到大海里,这滴水就会不停的扩散分布,扩散的越厉害越稳定,所以△G绝对值越大结构越稳定。
最后说一句,敢于尝试就会成功。
第二贴
--科室工作很多,小医生了,没有办法,所以肯怕不能满足很多战友的要求(qq聊或帮助设计),在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下,不一定正确,供参考吧。
--1、两个评价系统不一样,个人感觉oligo评价引物好点,primer出来的引物,我一般按效率排序,再结合退火温度和引物长度,选择引物到oligo测试。这是初步的选择,其实引物到了oligo里,退火温度也不一样。
--2、3端的二聚体应该避免,这个要看你的退火温度决定,一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了,一般来讲尽量控制在-4.5kcal/mol以下(个人观点,很多东西真得还是需要自己摸索)。
--3、个人感觉3端有A无A影响不大,3端有T的没有经验。有T是不是一定不行,个人感觉不见得。软件是评估,法则也不是没有例外,不是1+1=2那么确定。
--4、错配和二聚体谁轻谁重,个人觉得“到致命的程度”谁都重要,我也说不好。我设计的时候,尽量两个都不得罪。
--5、GC含量并非不重要,它直接影响引物各端稳定性,3端来两个G或C,稳定性就上去了,粘在模板上很牢。所以我设计的时候,尽量避免这样的情况出现。
谈一下我学这个引物设计的过程吧:
入门--前面我说过是我的大师兄把我领进门的,之后我就自己捣鼓。一开始严格按照引物设计的黄金法则来,primer搜出来的引物oligo评估,我就这样一条引物一条引物地反复评估,不厌其烦,到处查阅资料,一做就是几个小时,幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。
提高--有了成功的经验后,就继续做,当时我们实验室要定很多引物,我就有了练手的素材,这也很重要--什么东西不是练出来?!设计多了,问题也多了。有些引物按黄金法则来,行不通了,怎么办?
1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基,再反复评估
2、有些引物还不行,我就把5端突变一个碱基,再反复评估
3、再不行,我就放宽条件。放宽到什么样可以,不好说,自己摸索。有的 一对引物,其中一条错配很厉害,而另一条很可以,在没有其它选择的情况下为什么不可以。
有的人担心,这不一定跑的出来啊。对自己要有信心啊,原因有二:1.自己的引物谁有功夫帮你设计?所以啊,当时我就被“赶鸭子上架了”,反反复复搜索评估的基础上,出来的应该是目前最好的;2、还有,我经常看国外文章的引物,有的评估起来表面上差的要命,人家照用,结果还不是出来了。我就分析这样的引物,得出经验,胆子也大了。当然失败肯定是有一两次的。当然,有人说我就设计那么一条引物,输不起。那只好说Sorry了!
总之,我的经验就是:立即上手,遇到问题再解决问题,不厌其烦,不就是个软件嘛,还征服不了?!
第三贴
wuzhang2050 wrote:
个人觉得引物很有必要在NCBI上BLAST一下,看看非特异性引发如何!
楼主说得很对,设计引物的最后一步就是验证引物的特异性,我有一贴就是说引物验证的,在此不赘述,见下:
鉴于BLAST界面已改变,本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11865624&sty=1&tpg=1&age=0
注:个人感觉一对引物设计出来,即使不做blast,非特异性引发的可能性也不是很大,当然这一步在设计引物里是不可省略的。怎样增加blast检测中非特异性引发的可能性,我想也许可以增加expect值(见教程参数设置),给它设置成2000、3000、5000.....。老版本,原来有个short片断 blast的,可以用来验证引物,里面Expect(期望值)默认是1000,我试过5000,没有看出有什么可观的改变,所以1000够了。我猜想,Expect值增大,"非特异性引发的可能性"能够更好地被检测出,感兴趣的战友可以试试。
申明:个人意见,或对或错,有兴趣的战友可以自己测试一下
图1