【心得】引物设计其实很简单，敢于尝试就会成功
丁香园论坛
3016
因为有热心战友的不断提问，“【心得】引物设计其实很简单，敢于尝试就会成功”就增加到三贴了，我把它们合并一下，方便战友指正吧！
第一贴
记得当时搞引物设计的时候，还是我的大师兄领入门的，在此谢过了。师兄教了一些基本原则后，就放羊了。接着自己捣鼓来捣鼓去，在导师的实验室内设计了十几条引物，用起来还蛮好的，逐渐赚了点名气。后来，就和上海鼎安合作了，帮别人设计引物在他们公司订购引物，拿点回扣。别人拿给我设计的引物，都是很头痛。因为客户往往都是自己捣鼓一下，不行了才到我这。到现在已经成功设计了四五十对引物了。不过至今money颗粒无收，就不了了之，主要是客户拖欠的问题，不过不后悔，毕竟是不错的经历啊。所以，也算是有点个人观点，和大家分享，不对的地方请指正。
我用Primer 5.0搜索引物、Oligo 6.0评估引物，这是根据各自所长定的。但有个朋友，他就只用Oligo，说设计的引物也还可以。
Primer 5.0搜索引物：
1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。
4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
Oligo 6.0评估引物：
1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
2.Hairpin Formation根据黄金法则
3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
最后说一句，敢于尝试就会成功。
第二贴
－－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。
－－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
－－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
－－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
－－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。
－－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。
谈一下我学这个引物设计的过程吧：
入门－－前面我说过是我的大师兄把我领进门的，之后我就自己捣鼓。一开始严格按照引物设计的黄金法则来，primer搜出来的引物oligo评估，我就这样一条引物一条引物地反复评估，不厌其烦，到处查阅资料，一做就是几个小时，幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。
提高－－有了成功的经验后，就继续做，当时我们实验室要定很多引物，我就有了练手的素材，这也很重要－－什么东西不是练出来？！设计多了，问题也多了。有些引物按黄金法则来，行不通了，怎么办？
1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基，再反复评估
2、有些引物还不行，我就把5端突变一个碱基，再反复评估
3、再不行，我就放宽条件。放宽到什么样可以，不好说，自己摸索。有的 一对引物，其中一条错配很厉害，而另一条很可以，在没有其它选择的情况下为什么不可以。
有的人担心，这不一定跑的出来啊。对自己要有信心啊，原因有二：1.自己的引物谁有功夫帮你设计？所以啊，当时我就被“赶鸭子上架了”，反反复复搜索评估的基础上，出来的应该是目前最好的；2、还有，我经常看国外文章的引物，有的评估起来表面上差的要命，人家照用，结果还不是出来了。我就分析这样的引物，得出经验，胆子也大了。当然失败肯定是有一两次的。当然，有人说我就设计那么一条引物，输不起。那只好说Sorry了!
总之，我的经验就是：立即上手，遇到问题再解决问题，不厌其烦，不就是个软件嘛,还征服不了？！
第三贴
楼主说得很对，设计引物的最后一步就是验证引物的特异性，我有一贴就是说引物验证的，在此不赘述，见下：
鉴于BLAST界面已改变，本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11865624&sty=1&tpg=1&age=0
注：个人感觉一对引物设计出来，即使不做blast,非特异性引发的可能性也不是很大，当然这一步在设计引物里是不可省略的。怎样增加blast检测中非特异性引发的可能性，我想也许可以增加expect值(见教程参数设置)，给它设置成2000、3000、5000.....。老版本，原来有个short片断 blast的，可以用来验证引物，里面Expect(期望值)默认是1000，我试过5000，没有看出有什么可观的改变，所以1000够了。我猜想，Expect值增大，"非特异性引发的可能性"能够更好地被检测出,感兴趣的战友可以试试。
申明：个人意见，或对或错，有兴趣的战友可以自己测试一下
图1
第一贴
记得当时搞引物设计的时候，还是我的大师兄领入门的，在此谢过了。师兄教了一些基本原则后，就放羊了。接着自己捣鼓来捣鼓去，在导师的实验室内设计了十几条引物，用起来还蛮好的，逐渐赚了点名气。后来，就和上海鼎安合作了，帮别人设计引物在他们公司订购引物，拿点回扣。别人拿给我设计的引物，都是很头痛。因为客户往往都是自己捣鼓一下，不行了才到我这。到现在已经成功设计了四五十对引物了。不过至今money颗粒无收，就不了了之，主要是客户拖欠的问题，不过不后悔，毕竟是不错的经历啊。所以，也算是有点个人观点，和大家分享，不对的地方请指正。
我用Primer 5.0搜索引物、Oligo 6.0评估引物，这是根据各自所长定的。但有个朋友，他就只用Oligo，说设计的引物也还可以。
Primer 5.0搜索引物：
1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。
4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
Oligo 6.0评估引物：
1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
2.Hairpin Formation根据黄金法则
3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
最后说一句，敢于尝试就会成功。
第二贴
－－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。
－－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
－－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
－－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
－－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。
－－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。
谈一下我学这个引物设计的过程吧：
入门－－前面我说过是我的大师兄把我领进门的，之后我就自己捣鼓。一开始严格按照引物设计的黄金法则来，primer搜出来的引物oligo评估，我就这样一条引物一条引物地反复评估，不厌其烦，到处查阅资料，一做就是几个小时，幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。
提高－－有了成功的经验后，就继续做，当时我们实验室要定很多引物，我就有了练手的素材，这也很重要－－什么东西不是练出来？！设计多了，问题也多了。有些引物按黄金法则来，行不通了，怎么办？
1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基，再反复评估
2、有些引物还不行，我就把5端突变一个碱基，再反复评估
3、再不行，我就放宽条件。放宽到什么样可以，不好说，自己摸索。有的 一对引物，其中一条错配很厉害，而另一条很可以，在没有其它选择的情况下为什么不可以。
有的人担心，这不一定跑的出来啊。对自己要有信心啊，原因有二：1.自己的引物谁有功夫帮你设计？所以啊，当时我就被“赶鸭子上架了”，反反复复搜索评估的基础上，出来的应该是目前最好的；2、还有，我经常看国外文章的引物，有的评估起来表面上差的要命，人家照用，结果还不是出来了。我就分析这样的引物，得出经验，胆子也大了。当然失败肯定是有一两次的。当然，有人说我就设计那么一条引物，输不起。那只好说Sorry了!
总之，我的经验就是：立即上手，遇到问题再解决问题，不厌其烦，不就是个软件嘛,还征服不了？！
第三贴
wuzhang2050 wrote:
个人觉得引物很有必要在NCBI上BLAST一下，看看非特异性引发如何！
楼主说得很对，设计引物的最后一步就是验证引物的特异性，我有一贴就是说引物验证的，在此不赘述，见下：
鉴于BLAST界面已改变，本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11865624&sty=1&tpg=1&age=0
注：个人感觉一对引物设计出来，即使不做blast,非特异性引发的可能性也不是很大，当然这一步在设计引物里是不可省略的。怎样增加blast检测中非特异性引发的可能性，我想也许可以增加expect值(见教程参数设置)，给它设置成2000、3000、5000.....。老版本，原来有个short片断 blast的，可以用来验证引物，里面Expect(期望值)默认是1000，我试过5000，没有看出有什么可观的改变，所以1000够了。我猜想，Expect值增大，"非特异性引发的可能性"能够更好地被检测出,感兴趣的战友可以试试。
申明：个人意见，或对或错，有兴趣的战友可以自己测试一下
图1
