【原创】WB实验的心得(入门级)

western blot是现在实验技术中较常用但又不好控制的实验技术。近一月，一直在攻克这个高地，目前尚在努力中，有些心得想给大家聊聊。希望对大家的实验有点点帮助。


1)蛋白提取和定量：

A.组织蛋白提取过程中，匀浆是一个多因素影响的过程，除了根据实验目的要加入各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等之外，匀浆操作本身也有讲究。在其他条件都一致的情况下，匀浆操作尽量是一个人进行（手法一致，否则蛋白浓度和含量有差异）。

B.所提取的蛋白，要注意分装、低温保存，或者100度加热制备成样品。

C.蛋白定量，采用最简单的考马斯亮蓝就可以了，要特别精确的定量似乎没有必要。毕竟整个实验也只是半定量、看趋势的。


2)SDS-PAGE：

A.制胶之后上样之前，最好要用电泳液将每个点样孔都冲洗干净（5ml注射器就比较好用），否则条带有可能不规则。

B.制胶时，严格按照分子克隆上介绍的方法和配方操作，PH值也要调好，凝固太快或太慢都不行、不凝固也很麻烦，漏胶也很狼狈。这些都需要充足的准备工作。

C.上样量按照蛋白浓度换算，大约每孔上20－30ug就行，多了条带也不行。


3)转膜：

A.尽管有许多通用的方法出现在各种指南上、网站上，但还是需要结合自己的实验，进行适当的修正。

B.遇大分子蛋白，转膜时间要延长；甲醇有利于蛋白与膜结合，但却缩小凝胶孔径而不利于转膜；SDS有利于蛋白质从膜上转出，但不利于蛋白结合。

C.转膜可在4度进行，过夜；也可在冰内进行，2－3h，但必须注意随时观察转膜槽周围的冰，看看是否有完整的冰块紧贴在槽壁上，如果不但没有贴上反而融化出一些大窟窿，就说明转膜温度太高，需要降低电压/电流，或者加强散热处理。温度高，必然影响转膜效果，严重时凝胶显著变形、碎裂，膜也皱索、移位，等。

D.通常Tris-甘氨酸转膜Buffer(pH8.3)可以满足大多数蛋白质转膜的要求。但对于等电点等于或高于此的蛋白质，最好选用碱性更强的缓冲液转膜(例如CAPS,pH11)，否则转膜不完全，甚至转不上.


4)杂交：

A.抗体的稀释度需要反复摸索；有时候问题就出在抗体上，而不是操作本身的问题。换抗体就出结果也是常有的。

B.抗体回收应用问题，我们一般将首次使用后的抗体放4度冰箱，可以反复使用多次。我们的经验是，只要抗体液没有肉眼可见的沉淀，都还可以用。

C.如果是用ECL检测信号，二抗的浓度一定要低，这样背景才干净。我们通常用1:1万－1:5万的稀释度，不要怕浓度不够。


5)检测：

A.ECL现在是比较看好的试剂，但价格还是比较贵，我们一般用PIRECE的。

B.ECL在使用过程中时常有荧光淬灭的现象出现，不好避免。

C.ECL试剂用量，我们6cm×8cm大小的PVDF膜一般用0.5－0.8ml(两种液混合后的总体积)就可以取得较好的效果。

D.显影液和定影液也要在进行ECL试剂反应之前检查好、验证好（在暗室内首先看液体性状、配制时间，再用没有曝光的小胶片验证一下显影和定影效果），否则会在最后一步吃亏。

E.X光片，选择Kodak的就比较好，没有必要用进口的，主要是不要让片子在检测之前就“有一定程度的曝光”，那样会导致最终的片子背景不干净。

一点粗浅的心得，还有待进一步修正。