【原创】入门级T载体构建过程
丁香园论坛
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在丁香园见过很多大佬分享载体构建经验，所以我这里写的T载体构建只能算是入门级，给新手提供一点思路，有什么不足之处还希望大家多多指正。
我克隆的这个片段大小是1.8kb，用的是TaKaRa的LA-Taq酶做的PCR。
反应体系：undefinedbuffer 5 ul
MgCl2 5 ul
dNTPs 8 ul
Primer 1 1 ul
Primer 2 1 ul
LA-Taq 0.5 ul
cDNA 1 ul (1ug左右基因组DNA）
ddH2O up to 50 ul
按照TaKaRa的说明书，我用了Cool Start法，就是所有操作和试剂都是放在冰上进行的，据说能够减少非特异性。我当时担心目的基因量不够，所以P了两管，分到四个孔跑胶回收的。胶回收用的是OMEGA的试剂盒。
切胶回收之后测得目的片段浓度大概为20 ng/ul。按照TaKaRa的pMD18T说明书的要求，pMD18T需要加入1 ul，而目的片段需要0.1 pmol-0.3 pmol，换算一下，需要的目的片段的量大概为0.undefined180undefined325=58500 pg=58.5 ng到0.undefined180undefined325=175500 pg=175.5 ng，因此需要的目的片段大概为2.9 ul-8.8 ul。而该反应体系中允许的目的片段最大量为4 ul，我按照最大量加入的。混匀后加入Solution I，16度连接了大概一个小时。然后转化Top 10感受态，冰上20 min， 42度90s，冰上2 min。然后加入900 ul LB 37度培养1小时，取200 ul涂板。第二天过来大概长了20个克隆，我挑了12个，摇了大概3个小时，做了菌液PCR，最后阳性的克隆只有两个。
我把这两个克隆小摇了一下，小提了质粒，做了酶切。（Kpn I和EcoR I是我的引物上带的位点）
酶切鉴定完了之后，从6号和7号克隆菌液中各取了1 ml送测序。结果6号有两个位点突变，还少了一小段，7号正确，算是运气比较好吧。接下来的操作，论坛上已经有很多大佬说过了，到了这一步之后，可能后面遇到的主要问题就是连接。Takara的T4连接酶说明书上说，载体与目的片段分别是0.03 pmol和0.3 pmol，也就是1:10。我一般就是按照说明书做的，效果也还行。但是，我做的片段都比较短，可能大片段的话要调整比例，按照之前各位战友的说法，一般认为是1:3-1:10之间，片段越小，同载体的比例越大。
说明书很重要，每个公司的试剂都会有些细微的差别，细节决定成败。
潜水了很久，第一次在论坛发帖，主要是我最近也在折腾载体这个东西，所以发上来，希望能给新手们带去点有用的东西，节约点时间。求轻喷
我克隆的这个片段大小是1.8kb，用的是TaKaRa的LA-Taq酶做的PCR。
反应体系：undefinedbuffer 5 ul
MgCl2 5 ul
dNTPs 8 ul
Primer 1 1 ul
Primer 2 1 ul
LA-Taq 0.5 ul
cDNA 1 ul (1ug左右基因组DNA）
ddH2O up to 50 ul
按照TaKaRa的说明书，我用了Cool Start法，就是所有操作和试剂都是放在冰上进行的，据说能够减少非特异性。我当时担心目的基因量不够，所以P了两管，分到四个孔跑胶回收的。胶回收用的是OMEGA的试剂盒。
切胶回收之后测得目的片段浓度大概为20 ng/ul。按照TaKaRa的pMD18T说明书的要求，pMD18T需要加入1 ul，而目的片段需要0.1 pmol-0.3 pmol，换算一下，需要的目的片段的量大概为0.undefined180undefined325=58500 pg=58.5 ng到0.undefined180undefined325=175500 pg=175.5 ng，因此需要的目的片段大概为2.9 ul-8.8 ul。而该反应体系中允许的目的片段最大量为4 ul，我按照最大量加入的。混匀后加入Solution I，16度连接了大概一个小时。然后转化Top 10感受态，冰上20 min， 42度90s，冰上2 min。然后加入900 ul LB 37度培养1小时，取200 ul涂板。第二天过来大概长了20个克隆，我挑了12个，摇了大概3个小时，做了菌液PCR，最后阳性的克隆只有两个。
我把这两个克隆小摇了一下，小提了质粒，做了酶切。（Kpn I和EcoR I是我的引物上带的位点）
酶切鉴定完了之后，从6号和7号克隆菌液中各取了1 ml送测序。结果6号有两个位点突变，还少了一小段，7号正确，算是运气比较好吧。接下来的操作，论坛上已经有很多大佬说过了，到了这一步之后，可能后面遇到的主要问题就是连接。Takara的T4连接酶说明书上说，载体与目的片段分别是0.03 pmol和0.3 pmol，也就是1:10。我一般就是按照说明书做的，效果也还行。但是，我做的片段都比较短，可能大片段的话要调整比例，按照之前各位战友的说法，一般认为是1:3-1:10之间，片段越小，同载体的比例越大。
说明书很重要，每个公司的试剂都会有些细微的差别，细节决定成败。
潜水了很久，第一次在论坛发帖，主要是我最近也在折腾载体这个东西，所以发上来，希望能给新手们带去点有用的东西，节约点时间。求轻喷
