【原创】载体构建血泪史
丁香园论坛
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坑爹啊，一个载体构建，花了我四个月时间，往事不堪回首，为了各位兄弟姐妹们避免重蹈我的覆辙，我就一把鼻涕一把泪的给大家倾诉一下。
构建之前啊，我就翻丁香园啊，把里面关于载体构建的精华看了一遍啊，然后呢，以为构建载体很简单啊，以为一个月能搞定啊，所以满心欢喜的就开工了啊。
实验室没有载体，就跟别人借。载体借到了，按照文献里报道的选了两个酶切位点，离的太近，先单酶切验证，一切正常。接着往地下做，为了省时间，选用PCR产物直接双酶切连。连啊连，一个月时间过去了，没一点效果，载体双酶切，分别单酶切，怎么做怎么没有，郁闷啊。
一天忽然心血来潮，给载体酶切位点测个序吧，顺便把PCR产物连个T载体也来测个序。这一测吓一跳，载体竟然不是我想要的载体，更为诡异的是引物的酶切位点竟然犹豫引物公司疏忽，把我的酶切位点和错了，无语了，叫天天不应，叫地地不灵啊。
收拾一番，重头再来。在去借了点目的载体，这次学乖了，载体来之后先去测个序，确定之后再接着往下做。PCR产物由于有前车之鉴，选择先连T载体，测序，再连接。酶切位点没错，引物合成没问题，载体没问题。但是更为诡异的事情出现了。基因突变，我PCR啊PCR啊，从普通Taq酶，到TAQ-PLUS，再到LA-TAQ，测了三次，都突变，而且突变位点出奇的一致，坐不住了，查NCBI，比较来比较去，我勒个去，在某个角落里，发现了跟我的测序序列一致的基因序列，原来我们选择的大鼠是如此另类，这么多年来，只有一个实验室遇到了跟我们相同的情况，该基因序列因大鼠种类不同。我想笑，又想哭。
然后，载体酶切出场了，两个酶切位点，离的太近，双酶切之后连接，载体自连；分别单酶切，继续自连；CIAP处理吧，处理完之后继续自连。怎么回事啊，逛论坛，坛子里有人说BamH1不好去磷酸化，我就想着换个酶切位点试一下吧，把BamH1换成Hind3，死马当活马医吧。这一换，豁然开朗，PCR产物直连，连T载体之后再连，怎么连怎么有。
载体构建的血泪史到此重于告一段落了。
在此，小弟有几条经验想告诫各位战友，个人意见，仅供参考，如有雷同，纯属巧合。
1 跟别人借的载体，在用之前一定要测序，从源头杜绝。
2 基因序列在实验之前一定要查清楚，看看有没有什么亚型，有没有什么另类，不要像我那样给搞的狼狈不堪。
3 酶切位点的选择。尽量不要选离的太近的两个酶切位点吧。BamH1去磷酸化真的效果不好。
4 关于PCR产物直接双酶切连载体还是连T载体之后再做。刚开始做的时候倾向于前者，现在倾向有后者，个人看法。
最后，希望各位战友们实验顺利，工作顺利，生活顺利！！！
构建之前啊，我就翻丁香园啊，把里面关于载体构建的精华看了一遍啊，然后呢，以为构建载体很简单啊，以为一个月能搞定啊，所以满心欢喜的就开工了啊。
实验室没有载体，就跟别人借。载体借到了，按照文献里报道的选了两个酶切位点，离的太近，先单酶切验证，一切正常。接着往地下做，为了省时间，选用PCR产物直接双酶切连。连啊连，一个月时间过去了，没一点效果，载体双酶切，分别单酶切，怎么做怎么没有，郁闷啊。
一天忽然心血来潮，给载体酶切位点测个序吧，顺便把PCR产物连个T载体也来测个序。这一测吓一跳，载体竟然不是我想要的载体，更为诡异的是引物的酶切位点竟然犹豫引物公司疏忽，把我的酶切位点和错了，无语了，叫天天不应，叫地地不灵啊。
收拾一番，重头再来。在去借了点目的载体，这次学乖了，载体来之后先去测个序，确定之后再接着往下做。PCR产物由于有前车之鉴，选择先连T载体，测序，再连接。酶切位点没错，引物合成没问题，载体没问题。但是更为诡异的事情出现了。基因突变，我PCR啊PCR啊，从普通Taq酶，到TAQ-PLUS，再到LA-TAQ，测了三次，都突变，而且突变位点出奇的一致，坐不住了，查NCBI，比较来比较去，我勒个去，在某个角落里，发现了跟我的测序序列一致的基因序列，原来我们选择的大鼠是如此另类，这么多年来，只有一个实验室遇到了跟我们相同的情况，该基因序列因大鼠种类不同。我想笑，又想哭。
然后，载体酶切出场了，两个酶切位点，离的太近，双酶切之后连接，载体自连；分别单酶切，继续自连；CIAP处理吧，处理完之后继续自连。怎么回事啊，逛论坛，坛子里有人说BamH1不好去磷酸化，我就想着换个酶切位点试一下吧，把BamH1换成Hind3，死马当活马医吧。这一换，豁然开朗，PCR产物直连，连T载体之后再连，怎么连怎么有。
载体构建的血泪史到此重于告一段落了。
在此，小弟有几条经验想告诫各位战友，个人意见，仅供参考，如有雷同，纯属巧合。
1 跟别人借的载体，在用之前一定要测序，从源头杜绝。
2 基因序列在实验之前一定要查清楚，看看有没有什么亚型，有没有什么另类，不要像我那样给搞的狼狈不堪。
3 酶切位点的选择。尽量不要选离的太近的两个酶切位点吧。BamH1去磷酸化真的效果不好。
4 关于PCR产物直接双酶切连载体还是连T载体之后再做。刚开始做的时候倾向于前者，现在倾向有后者，个人看法。
最后，希望各位战友们实验顺利，工作顺利，生活顺利！！！
