牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态学演变

牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态学演变

　　一、目的要求

　　1．通过生牛乳的自然发酵了解牛乳酸败过程中细菌的生态学演变过程。

　　2．了解酸牛乳的制作原理。

　　二、基本原理

　　刚采集的生牛乳含有少量不同的细菌，而牛乳的成分对细菌来讲是一种很好的营养基质，因此，在温暖的条件下，细菌即开始很快地繁殖。然而也不是所有的细菌都能如此，由于当时生牛乳的pH是中性，含有丰富的乳糖，故有利于其中自然存在的乳酸细菌例如乳链球菌（Streptococcus lactis）很快地繁殖。它们发酵乳糖产生乳酸，使牛乳的pH降低，并引起蛋白质凝结成乳酪状。

这低的PH最终抑制了乳链球菌的繁殖，被比较能耐受低pH的发酵乳糖的菌种乳杆菌（Lactobacillus）所代替，它们完成乳糖发酵，并使pH更加降低。接着是酵母菌在这种低pH下利用乳酸而生长。

随着乳糖和乳酸的消失，pH再度上升，假单孢菌（Pseudomonas）和芽胞杆菌（Bacillus）能产生蛋白酶，开始分解凝结了的牛乳蛋白质，当蛋白质被利用完毕，牛奶的分解也就完成了。

　　生牛乳的这种生态学演变的自然过程是一个典型的例子。原始细菌的活动为以后的细菌创造了有利的生化条件，因而能观察到一个微生物群体接替另一微生物群体的一系列演变。这种自然演变的基本原则也能在地面环境中的高等植物和动物中实现。自然界其他微生物也会发生同样的演变过程。

　　巴斯德消毒法的目的是杀灭牛乳中的病原菌，但不能杀灭芽胞杆菌，经此法消毒过的牛乳，破坏了其中的正常菌群（除芽胞杆菌以外），因而不能产生带酸味的酸牛乳——典型的乳酪牛乳，但能越过演变的早期而趋向于更不适用的最后时期。故牛乳酸败的自然过程与食品工业有密切的关系。

现代工业生产的酸牛乳是先将牛乳进行消毒，而后接种乳链球菌与乳杆菌的纯种。

　　本实验是将生牛乳原始样品与以后培养在 30℃下约每两天取一次的样品分别测其pH和涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察主要细胞的形态、排列、革兰氏阳性或阴性以及单个视野中的平均细菌数。由于每次涂片均取一个接种环，涂抹玻片约2．5cm2 的面积，因此，所测菌数的结果将是半定量的。

　　三、器材

　　生牛乳样品放灭菌小三角烧瓶内，约1/2瓶；

　　中性到酸性的pH试纸，玻片，革兰氏染液、二甲苯，显微镜等。

　　四、操作步骤

　　1．旋转装牛乳的三角烧瓶，使样品充分混匀。

　　2．用灭菌滴管或接种环以无菌手续取一滴牛乳，放在pH试纸上，比色，读结果，记录于“结果”的表格内。

　　3．用无菌手续取满一接种环牛乳，在玻片上均匀涂抹2．5cm2 面积（可先在纸上画2．5cm2 的方格，然后将玻片放在纸上），玻片标明日期。

　　4．玻片放空气中干燥。贮存在一有盖盒内，待整个实验的所有涂片制成后一起进行第7以后的步骤或每片先进行第7步骤，再贮存，待所有玻片制成后再进行第8以后的步骤。

　　5．牛乳样品放30℃温箱内培养。整个实验（约需10天）均需在此温度下培养。

　　6．每两天重复取样测pH和制作涂片。每次制作涂片用同一接种环，取同样的量。直至牛乳完成变酸过程和开始腐败为止。

　　7．所有涂片都用二甲苯处理约一分钟，以除去牛乳的脂肪，干燥后，火焰固定。

　　8．革兰氏染色。

　　9．油镜下观察，数几个视野的主要类型的细菌数，计算每一视野的平均数，描写细菌类型，注明形态（杆状或球状）、大小（长或短，细长或宽大）以及排列（单个或呈链状）等。

　　整个生态演变过程可分为四个时期，下面介绍每一时期的pH与主要细菌及细菌的特点，作为记录与解释所得结果的指导。但不能指望每组结果与这一指导完全一致，因为此实验结果常因原始样品中细菌的数量和种类、培养温度和其他环境因素的不同而不同的。

　　第一时期（pH6．0—7．0）乳链球菌：革兰氏阳性，呈链状排列。在中性pH下繁殖与发酵乳糖而产生乳酸。

　　第二时期（pH 3．5—4．0）乳杆菌属：细长的革兰氏阳性杆菌，常呈链状，在比较低的pH下繁殖，完成乳糖的发酵。

　　第三时期（ pH 4．0— 5． 0）酵母菌：大革兰氏阳性、卵圆形细胞，在低 pH下繁殖，利用乳酸，因而 pH再次增高。

　　第四时期（pH 5． 0—6．5）腐败微生物：有假单胞菌属和芽孢杆菌属。假单胞菌属为小革兰氏阴性杆菌，单个存在；芽孢杆菌属为大革兰氏阳性杆菌，常呈链状，当营养耗尽时还可能产生芽孢。它们在较高的更碱性的pH下繁殖，消化蛋白质凝乳和利用氨基酸作为营养物质。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　(1)记录每次测得的pH和描写涂片中所观察到的细菌，并根据描写的细菌情况对照所介绍的各个时期的细菌特点，鉴别细菌类型。最后计算每一类型细菌在油镜下平均每视野的近似数。

　　(2)用上表数据画曲线

　　(a)pH曲线以取样日期的垂直线与右面纵轴pH的水平线的交叉处画点，然后用连续线(——)连接各点。

　　(b)各细菌的曲线以取样日期与左面各类型细菌的每视野平均数画交叉点，然后按各菌的曲线标记连接各点画曲线。

　　2．思考题

　　(1)用你自己的实验结果说明细菌在牛乳的自然生态演变中是如何改变其环境的，又如何依次影响有关细菌的？

　　(2)经巴斯德消毒法消毒过的牛乳通过自然发酵，能否得到与生牛乳自然演变过程的同样结果？为什么？

　　(3)如果你利用生牛乳通过细菌自然发酵制造能饮用的酸牛乳，应控制在哪一时期？