发酵过程中无机磷的利用
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实验原理
酵母能使蔗糖和葡萄糖发酵产生乙醇和二氧化碳。此过程与无机磷将糖磷酸化有关。
本实验利用无机磷与钼酸形成的磷钼酸络合物能被还原剂α－1，2，4－氨基萘酚磺酸钠还原成钼蓝的原理来测定发酵前后反应混合物中无机磷的含量，用以观察发酵过程中无机磷的消耗。
试剂 和器材
- 试剂
蔗糖；5％三氯乙酸；3mol/L硫酸和2.5％钼酸铵等体积混合液。
磷酸盐溶液：称取Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 120.7g(或Na 2 HPO 4 ·2H 2 O 60g)和KH 2 PO 4 20g溶解于
蒸馏水中，定容至1000mL，在冰箱中贮存备用。临用前稀释适当倍数。
标准磷酸盐溶液：将磷酸氢二钾（KH 2 PO 4 ）在110℃烘箱中烘干2小时，冷却后准确称取0.1098g，用蒸馏水溶解，定容到1000 mL，成为每毫升溶液含25μg无机磷的标准磷酸盐溶液。
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸溶液：将0.25gα－1，2，4－氨基萘酚磺酸，15g亚硫
酸氢钠及0.5g亚硫酸钠溶于100 mL 蒸馏水中。使用前稀释三倍。
二、材料
新鲜啤酒酵母。
三、器材
试管 1.5×15cm（×15）；移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×2），5mL（×3）；锥形瓶50mL（×1）；水浴锅；研钵；滤纸；分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取9支 试管 编号后，按下表顺序加入试剂：
|
管号 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
标准磷酸盐溶液(mL) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
含磷量(μg) |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
|
蒸馏水(mL) |
3.0 |
2.8 |
2.6 |
2.4 |
2.2 |
2.0 |
|
钼铵酸－硫酸混合液(mL) |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
|
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸钠溶液(mL) |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
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充分混匀后，37℃ 水浴 保温10min |
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A600 |
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绘制标准曲线：以 A600 为纵坐标，含磷量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、酵母发酵
称取2 ~ 4g新鲜酵母和1g蔗糖，放入研钵内仔细研碎。加入5mL蒸馏水和5mL磷酸盐溶液研磨均匀。将匀浆转移至50mL 锥形瓶中并立即取出0. 5mL均匀的悬浮液，加入到已盛有3.5mL三氯乙酸溶液的试管中，摇匀作为试样1。将锥形瓶放入37℃恒温 水浴 中，每隔30分钟取出0. 5mL悬浮液，立即加入已盛有3. 5mL三氯乙酸溶液的试管中，摇匀。共取三次，作为试样2，3，4。将每个试样过滤后，得无蛋白滤液备用。
三、无机磷的测定
取五只干燥洁净的试管，编号后按下表加入各种溶液：
|
管号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
发酵时间(min) |
0 |
30 |
60 |
90 |
— |
|
无蛋白滤液(mL) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
— |
|
蒸馏 水(mL) |
2.9 |
2.9 |
2.9 |
2.9 |
2.9 |
|
钼铵酸－硫酸混合液(mL) |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
|
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸钠溶液(mL) |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
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充分混匀后，37℃水浴保温10min |
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A660 |
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从标准曲线上查处各试样的无机磷含量，以试样1的无机磷含量为100％，计算酵母发酵30、60和90分钟后消耗无机磷的相对百分数。
注意事项
在本实验的预备实验中，应首先摸索酵母的用量及磷酸盐的稀释倍数。使光吸收值在适当的范围内。
