文献解读 | CRISPR/Cas9 介导的基因编辑可以缓解亨廷顿病小鼠模型中的神经毒性

导语：来自美国埃默里大学医学院、中国科学院和暨南大学的研究人员在在 9 个月大的亨丁顿舞蹈症模式小鼠中利用通过一种病毒载体运送的 CRISPR/Cas9 切除它们的脑细胞中的 mHTT 基因的一部分。

几周后，在大脑中接受这种病毒载体注射的地方，这些蛋白聚集物几乎消失了。此外，这些小鼠的运动能力得到改善，不过没有恢复到健康小鼠的水平。

相关研究结果于 2017 年 6 月 19 日首次发表在 Journal of Clinical Investigation 期刊上，论文标题为“CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease”。本周由 GEMPLE 捷易技术部刘佩为大家详细解读此篇文献。

背景介绍：

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种常染色体显性、进行性、遗传性神经退行性疾病，是由HTT基因中一段 CAG 重复序列引起的。

在健康人体中，HTT 基因中 CAG 重复数目在 6-35 范围内，而超过35就会引起大范围的细胞功能障碍。mHTT 蛋白在脑细胞中形成聚集物，从而导致脑细胞死亡。它的症状通常在中年时出现，包括不受控制的运动、平衡问题、情绪波动和认知下降。

解读专栏：

01 研究思路

大量的临床研究为我们了解亨廷顿舞蹈症，进而治愈这种疾病奠定了坚实的基础，但，确定干预治疗的靶点和开发新的治疗方法仍是一个持续进行的过程。

在这个过程中有显著成效的是“基因沉默”的方法，其中包括 ASO（反义寡核苷酸）和 RNAi。这两种方法都需要根据患者的 mHTT 基因特异性设计。在本文献中，研究人员基于两项小鼠实验提出了一种非等位基因特异性的方法，即不需要根据病人的基因组定制。

研究人员首先利用条件性敲除小鼠实验揭示了在成年小鼠大脑中敲除正常的 HTT 基因并不影响小鼠的存活、生长和神经元活性；同时，在基因敲入小鼠实验中证明了敲除 HTT 的 N 末端区域对早期的胚胎发育是非必须的。

这些发现揭示了在不考虑等位基因的情况下，移除包含谷氨酰胺重复区（polyQ）的 HTT 的 N 末端部分可能是治疗亨廷顿舞蹈症的一种潜在的治疗方法。于是研究人员提出了一种基于 CRISPR/Cas9 的永久性抑制内源性 mHTT 基因表达的方法。

02 研究过程

1、CRISPR / Cas9 能够清除 HD 140Q-KI 纯合小鼠纹状体中 mHTT 的表达

研究人员先是构建了一个亨廷顿舞蹈症模式小鼠，该小鼠拥有人的 mHTT 基因，用于替换其体内正常的亨廷顿蛋白编码基因（normal huntingtin, nHTT）拷贝。在大约 9 个月大的时候，运动问题和 mHTT 蛋白聚集就能够在这些小鼠中观察到。

1、1 HTT-sgRNA 设计及活性分析

1、2 HD 140Q-KI 纯合小鼠纹状体中 CRISPR/Cas9 介导的 mHTT 的表达分析

2、研究 CRISPR / Cas9在 HD 140Q-KI杂合小鼠中的治疗潜能

大多数 HD 病人都是HTT基因的杂合突变，而且，神经元是最先受损的部位。于是研究人员接着在亨廷顿病杂合小鼠中研究 CRISPR / Cas9 的治疗这种疾病的可能性。

2.1 CRISPR / Cas9 清除 HD140Q-KI 杂合小鼠纹状体神经元中 mHTT 后的行为能力分析

2、测试杂合 HD140Q-KI 小鼠中 CRISPR / Cas9 的治疗潜力

2.2 CRISPR / Cas9 清除 HD140Q-KI 杂合小鼠纹状体神经元中的 mHTT 可以减轻其早期病理特征。

3、分析脱靶的可能性

尽管 CRISPR/Cas9 基因编辑的潜力已被广泛认知，但是它并未被用来在人体中治疗任何神经退行性疾病。这是因为还有几个问题需要加以解决，比如如何有效地将 DNA 运送到脑细胞中、如何安全地对脑细胞中的 DNA 进行调整，减少脱靶效应。

研究人员通过全基因组测序，对可能的脱靶位点进行分析，结果证实在脑细胞中，CRISPR/Cas9 触发的移码突变主要发生在 mHTT 基因内，而不是发生在其他的潜在脱靶基因中。

03 研究结果

1、在 HD140Q-KI 纯合小鼠中，mHTT 的 2 个等位基因都被 CRISPR/Cas9 敲除，研究人员发现移除mHTT基因并不影响 NeuN、Caspse3 的表达，相反，mHTT 的损耗显著减少了反应性星型胶质细胞的数量，这种细胞的出现增多是 HD 小鼠大脑中早期出现的一种病理反应，这些结果证明了在成年小鼠神经元中敲除 HTT 可能是无害的。

2、在 HD140Q-KI 杂合小鼠中，研究人员证实 CRISPR/Cas9 可以有效减缓 HD 相关表型。9 个月大的 HD 140Q-KI 小鼠 在纹状体中表现出大量核 mHTT 的聚集和明显运动障碍的问题。

CRISPR/Cas9 介导的基因失活可以逆转神经病理特征和行为表型，即使小鼠已经九个月大，说明在突变蛋白的表达被关掉的情况下，老的神经元依然有能力清除聚集的突变蛋白。

04 分析及讨论

相比较与其它的治疗方法需要持续进行，CRISPR/Cas9 可以永久地清除靶基因的表达，另一方面，许多神经退行性疾病的严重的神经系统症状与选择性神经元群的优先易损性有关，选择特定的启动子可以使 CRISPR/Cas9 特异性地发挥作用。

因此，使用 CRISPR / Cas9 抑制突变蛋白表达为治疗亨廷顿舞蹈症及其他神经退行性疾病（因为突变基因获得的毒性功能）开辟了一条新途径。不过将 AAV 注射到大脑中表达 CRISPR/Cas9 的长期效果和安全性仍然还需接受严格地测试，才有可能将这种方法应用于病人中。

以上就是文章《CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease》的全部内容啦，若有疑问欢迎随时咨询：021-60450870；我们下期文献详解再见！

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