ChIP测序小编分享对于ChIP-seq的测序小问题
武汉康测科技有限公司
1909
ChIP测序小编分享对于ChIP-seq的测序小问题如下：
1、ChIP-Seq 有什么样品要求？
1） 请供给浓度≥10 ng/ul、总量≥20 ng、OD260/280 为1.8~2.2 的DNA 样品；若单次ChIP 后DNA 量不够，主张将2~3 次ChIP 的DNA 兼并在一起。
2）请供给DNA 打断时检测胶图，要求打断后DNA 电泳主带在100-500bp 规模内；请对于ChIP 获得 DNA 规划引物进行QPCR 验证和定量，能够供给检测位点的检测报告，附阳性和阴性对照。
3）样品请置于1.5 ml 管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时刻，管口运用Parafilm 封口。在运送前将一切样品管固定于50 ml 带盖离心管中，再将50 ml 管放在封口袋中。为了避免低浓度样品黏附在离心管壁上，请运用non-stick tube 运送DNA ；主张运用冰袋运送，而且尽量选用较快的邮递办法，以下降运送过程中样品降解的可能性。
2、ChIP-Seq 测序文库的构建办法？
目前为止，唯有Illumina 在ChIP-seq 领域被广泛报道，采用Illumina 测序其ChIP-seq测序文库构建办法如下：
1）ChIP 富集DNA 片段。首要用甲醛将活体细胞交联，随后将细胞核内的染色质用超声波打断成目标长度（一般0.2-1kb）的短片段方式，用所研讨的蛋白特异性抗体将蛋白结合的DNA 片段免疫共沉积，接下来将蛋白质-DNA 复合物解交联并纯化DNA 片段。
2）构建测序文库。对于ChIP 富集的DNA 片段纯化后，经末端补平，3’末端加A，连接接头一系列处理后，进行电泳割胶，收回150-300bp 规模左右的片段，然后对收回的DNA 片段进行PCR 扩增，上机测序。所测序列首要进行基因组比对然后用不同的算法进行结合位点的统计。
3、ChIP-Seq 测序对照的挑选？
ChIP-seq 过程中，由于DNA 富集过程受多种要素的影响。因此，在做ChIP 试验时，必定要做好试验对照。因为没有对照，很难对试验成果的可靠性进行评价。一般有三种试验对照：Input 对照、阳性对照和阴性对照。
1）Input 对照：在进行免疫沉积前，需求取一部分开裂后的染色质做Input 对照。Input 是开裂后的基因组DNA，需求与沉积后的样品DNA 一起通过反转交联，DNA 纯化，以及最后的PCR 或其他办法检测。Input 对照不只能够验证染色质开裂的作用，还能够依据Input 中的靶序列的含量以及染色质沉积中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的功率，所以Input 对照是ChIP 试验必不可少的步骤。
2）阳性对照和阴性对照：阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的试验对照。阳性抗体一般挑选与已知序列相结合的比较保存的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II 抗体等。阴性抗体一般挑选意图蛋白抗体宿主的IgG 或血清。意图蛋白抗体的成果与阳性抗体和阴性抗体的成果相比较，才干得出正确定论。假如意图蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉积试验的抗体，只有其他用途的抗体时，能够先做蛋白质免疫沉积（Immunoprecipitation）检测。假如抗体能够成功的沉积蛋白，再进行染色质免疫沉积试验的检测。
4、只要采用高通量测序，就必定能够达到高分辨率？导致ChIP-seq 测序假阳性比较高的要素？
高通量的测序的确大大提高了ChIP 检测的分辨率，但并不是高分辨率的仅有决定要素。免疫富集后，染色质被打断的片段长度也会影响分辨率。DNA 打碎办法、染色质开放程度的不均一性、PCR 扩增偏向性、基因组的重复程度以及测序和序列比对过程中的错误都会引入系统误差造成假阳性，测序后首要将序列比对到已知基因组上并确立真正的结合位点（峰，peak）。对于转录因子，要寻找“峰”对应的下游调控基因（靶基因），或许构建转录因子结合位点的保存结合序列，假如转录因子的motif 是已知的，则能够计算“峰”序列中包括motif 序列的百分比，间接估量试验成果的可靠性。
5、样品制备过程中是否需求 PCR 扩增？PCR 扩增后是否会影响最后的成果？
由于 ChIP 下来的 DNA 样品量一般十分少，所以在样品制备过程中需求通过一步 PCR 扩增，首要是为了获得满足上机反响的 DNA 量。假如供给的 DNA 样品足量，可减少 PCR 循 环数或不进行 PCR 扩增。PCR 扩增有可能增加成果的偏向性。
6、哪些要素会影响 ChIP-Seq 的成果？
抗体的质量与特异性、试验规划、ChIP 的试验操作、DNA 片段长度规模、测序深度、测序质量等都会影响 ChIP-Seq 的成果。
以上文章来自ChIP测序，如有雷同请通知批改，如有转载请阐明出处，有需求请联络我们！
1、ChIP-Seq 有什么样品要求？
1） 请供给浓度≥10 ng/ul、总量≥20 ng、OD260/280 为1.8~2.2 的DNA 样品；若单次ChIP 后DNA 量不够，主张将2~3 次ChIP 的DNA 兼并在一起。
2）请供给DNA 打断时检测胶图，要求打断后DNA 电泳主带在100-500bp 规模内；请对于ChIP 获得 DNA 规划引物进行QPCR 验证和定量，能够供给检测位点的检测报告，附阳性和阴性对照。
3）样品请置于1.5 ml 管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时刻，管口运用Parafilm 封口。在运送前将一切样品管固定于50 ml 带盖离心管中，再将50 ml 管放在封口袋中。为了避免低浓度样品黏附在离心管壁上，请运用non-stick tube 运送DNA ；主张运用冰袋运送，而且尽量选用较快的邮递办法，以下降运送过程中样品降解的可能性。
2、ChIP-Seq 测序文库的构建办法？
目前为止，唯有Illumina 在ChIP-seq 领域被广泛报道，采用Illumina 测序其ChIP-seq测序文库构建办法如下：
1）ChIP 富集DNA 片段。首要用甲醛将活体细胞交联，随后将细胞核内的染色质用超声波打断成目标长度（一般0.2-1kb）的短片段方式，用所研讨的蛋白特异性抗体将蛋白结合的DNA 片段免疫共沉积，接下来将蛋白质-DNA 复合物解交联并纯化DNA 片段。
2）构建测序文库。对于ChIP 富集的DNA 片段纯化后，经末端补平，3’末端加A，连接接头一系列处理后，进行电泳割胶，收回150-300bp 规模左右的片段，然后对收回的DNA 片段进行PCR 扩增，上机测序。所测序列首要进行基因组比对然后用不同的算法进行结合位点的统计。
3、ChIP-Seq 测序对照的挑选？
ChIP-seq 过程中，由于DNA 富集过程受多种要素的影响。因此，在做ChIP 试验时，必定要做好试验对照。因为没有对照，很难对试验成果的可靠性进行评价。一般有三种试验对照：Input 对照、阳性对照和阴性对照。
1）Input 对照：在进行免疫沉积前，需求取一部分开裂后的染色质做Input 对照。Input 是开裂后的基因组DNA，需求与沉积后的样品DNA 一起通过反转交联，DNA 纯化，以及最后的PCR 或其他办法检测。Input 对照不只能够验证染色质开裂的作用，还能够依据Input 中的靶序列的含量以及染色质沉积中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的功率，所以Input 对照是ChIP 试验必不可少的步骤。
2）阳性对照和阴性对照：阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的试验对照。阳性抗体一般挑选与已知序列相结合的比较保存的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II 抗体等。阴性抗体一般挑选意图蛋白抗体宿主的IgG 或血清。意图蛋白抗体的成果与阳性抗体和阴性抗体的成果相比较，才干得出正确定论。假如意图蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉积试验的抗体，只有其他用途的抗体时，能够先做蛋白质免疫沉积（Immunoprecipitation）检测。假如抗体能够成功的沉积蛋白，再进行染色质免疫沉积试验的检测。
4、只要采用高通量测序，就必定能够达到高分辨率？导致ChIP-seq 测序假阳性比较高的要素？
高通量的测序的确大大提高了ChIP 检测的分辨率，但并不是高分辨率的仅有决定要素。免疫富集后，染色质被打断的片段长度也会影响分辨率。DNA 打碎办法、染色质开放程度的不均一性、PCR 扩增偏向性、基因组的重复程度以及测序和序列比对过程中的错误都会引入系统误差造成假阳性，测序后首要将序列比对到已知基因组上并确立真正的结合位点（峰，peak）。对于转录因子，要寻找“峰”对应的下游调控基因（靶基因），或许构建转录因子结合位点的保存结合序列，假如转录因子的motif 是已知的，则能够计算“峰”序列中包括motif 序列的百分比，间接估量试验成果的可靠性。
5、样品制备过程中是否需求 PCR 扩增？PCR 扩增后是否会影响最后的成果？
由于 ChIP 下来的 DNA 样品量一般十分少，所以在样品制备过程中需求通过一步 PCR 扩增，首要是为了获得满足上机反响的 DNA 量。假如供给的 DNA 样品足量，可减少 PCR 循 环数或不进行 PCR 扩增。PCR 扩增有可能增加成果的偏向性。
6、哪些要素会影响 ChIP-Seq 的成果？
抗体的质量与特异性、试验规划、ChIP 的试验操作、DNA 片段长度规模、测序深度、测序质量等都会影响 ChIP-Seq 的成果。
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