🔥 染色质免疫共沉淀测序（chip-seq）

染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前唯一研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法，主要包括 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 两种。利用 ChIP-seq 技术能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白修饰、转录因子等互作的 DNA 区段。

真核生物的基因组 DNA 以染色质的形式存在。使用甲醛将目的蛋白和 DNA 交联固定，并通过超声处理或核酸酶消化使染色质碎裂；再利用抗体特异性沉淀分离组蛋白或转录因子等及其结合的染色质，即染色质免疫共沉淀产物；通过蛋白酶解交联，使目的蛋白与 DNA 分开，纯化 DNA 后通过下一代测序 (NGS) 技术检测和定量富集的 DNA 片段。

用于分析与目的蛋白（转录因子或组蛋白）相互作用的 DNA 片段。

甲醛、甘氨酸、预冷的 PBS、ChIP 裂解缓冲液、洗脱缓冲液、氯化钠、RNase、蛋白酶 K、Tris-EDTA (TE)、100 bp DNA marker、 1.5% 琼脂糖凝胶、RIPA 缓冲液、一抗、Protein A/G 磁珠、低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液。

1.DNA-蛋白质交联和收集细胞

用甲醛交联蛋白质和 DNA。交联程序与时间有关，需要优化。

提示：样本的建议交联时间为 2~30 分钟，过度交联会降低抗原的可及性及超声效果，表位也可能被掩盖。加入甘氨酸封闭甲醛，终止交联反应。

1.1 首先，准备 2×10⁷~1×10⁸ 个细胞。直接向培养基中逐滴滴加甲醛，至终浓度为 0.75%，然后在室温下轻柔旋转 10 分钟，促使蛋白质与 DNA 交联。

1.2 向培养基中添加甘氨酸，至终浓度为 125 mM，室温下振荡孵育 5 分钟。

1.3 用 10 mL 冰的 PBS 冲洗细胞 2 次。

1.4 加入 5 mL 冰的 PBS，刮下细胞，移入离心管中。

1.5 4 ℃，1 000 g 离心 5 分钟。

1.6 小心吸取上清液，将沉淀重悬于 ChIP 裂解缓冲液中（每 10⁷ 个细胞加 750 μL），置于冰上孵育 10 分钟。

2. 对细胞裂解液进行超声处理，以分离染色质

2.1 对裂解液进行超声处理以剪切 DNA，并确保 DNA 的平均片段大小为 200~1 000 bp。超声处理时间需要优化。

2.2 超声处理完成后，4 ℃，8 000 g 离心 10 分钟，取上清液至新管中。

3. 计算 DNA 浓度，并测定 DNA 片段大小

经过超声处理的染色质样本可用于计算后续 IP 的 DNA 浓度，并电泳检测 DNA 片段大小。

3.1 取 50 μL 经超声处理的样本，测定 DNA 浓度和片段大小。

3.2 向 50 µL 染色质中加入 70 µL 洗脱缓冲液。

3.3 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A（10 mg/mL），65 ℃ 下振摇孵育过夜。

3.4 加入 2 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），60 ℃ 下振摇孵育 1 小时。

3.5 使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚：氯仿萃取法纯化 DNA。

3.6 为测定 DNA 浓度，取 5 μL 纯化 DNA，转移至含 995 μL TE 的试管中，稀释 200 倍，并读取 OD₂₆₀。DNA 浓度 (μg/mL) 为 OD₂₆₀×10 000。用于计算制备染色质的 DNA 浓度。在带 100 bp DNA marker 的 1.5% 琼脂糖凝胶中电泳纯化 DNA，以测定片段大小。

4. 染色质免疫沉淀（IP）

4.1 使用步骤 2.2 制备的染色质。建议每次 IP 使用约 25 μg DNA。按 1:10 的比例用 RIPA 缓冲液稀释每个样本。设置一个 IgG 抗体对照和一个仅加磁珠的对照。取 50 µL 染色质作为 input 样本，-20 ℃ 下保存备用。

4.2 在所有样本（仅加磁珠的对照除外）中加入一抗，并在 4 度下旋转孵育 1 小时。抗体用量应事先通过实验确定；一般来说，每 25 μg DNA 加入 1~10 μg 抗体（最佳抗体是经 ChIP 验证的抗体，IP 验证次之，抗体量参考厂家推荐）。

4.3 制备蛋白 A/G 磁珠（按照实验选择适合磁珠）

4.4 在所有样本中加入 60 µL 蛋白 A/G 磁珠，4 ℃ 下旋转过夜。

4.5 2 000 g 离心 1 分钟，除去上清液。

4.6 按照以下步骤进行洗涤：分别在低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液和氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。每次洗涤后，2 000 g 离心 1 分钟，除去上清液。

5. 洗脱并解交联

5.1 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液，以洗脱 DNA，30 ℃ 下缓慢涡旋 15 分钟。

5.2 2000 g 离心 1 分钟，并将上清液转移至新管中。

5.3 加入 4.8 µL 5 M NaCl 和 2 µL RNase A（10 mg/mL），65 ℃ 下振摇孵育过夜。

5.4 加入 2 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），60 ℃ 下振摇孵育 1 小时。

5.5 DNA 可使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取法进行纯化。

6. ChIP-seq 分析 DNA 水平

使用 ChIP-seq 方法时，通过测序进行 DNA 水平分析。使用该方案产生的 DNA 适合用作制备测序文库的 input。

1. 蛋白 A 和 G 磁珠对各种属不同免疫球蛋白同种型的亲和力不同，根据使用的 IP 抗体选用。

2. 如果观察到高背景，可能需要增加洗涤步骤。也可以在步骤 4.2 之前，预先用蛋白 A/G 磁珠孵育 1 小时，去除与磁珠发生的非特异性结合。将上清液（经过超声处理的染色质）转移至一个新管中，然后按照步骤 4.2 对抗体和磁珠进行孵育。

1. 为什么使用RNase A？

使用 PCR 纯化试剂盒时，高水平的 RNA 会干扰 DNA 纯化，因此需要使用 RNase A 处理样本。否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。

2. 为什么使用蛋白酶 K？

用蛋白酶 K 处理样本，可使邻近脂肪与芳香族氨基酸羧基的肽键断裂。从而破坏蛋白质和 DNA 之间的交联，促进 DNA 的纯化。

3. 染色质消化片段过大（>1 000 bp）或过小（<150 bp）。

过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

添加至染色质消化的细胞不足。

不同细胞系所需的超声处理时间不同。

4. 阴性对照 IgG-IP 和实验组抗体 IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者，添加至 IP 反应的抗体过多。

5. 实验组抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。