免疫亲和层析细胞分选的技术原理

​免疫亲和层析法常用于蛋白质等生物大分子的纯化。但你是否想过，一根亲和层析柱子也能用来进行细胞分选，而且还不使用高亲和力抗体？

 

在细胞分选中，我们常常利用免疫识别特性来进行，比如流式分选 (FACS)和免疫磁分选 (MACS)。

免疫细胞的划分是依据表面标志 CD 分子，可以被抗体识别。比如针对 CD4 + T 细胞这一特定类群，表面含有 CD45、CD3 和 CD4 标记。而表达 CD4 就是辅助性 T 细胞的特征。

由此而来，免疫磁分选利用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后，再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法，还是要看下游的研究。如果，想在选出的 CD4 +T 细胞上做基因功能研究，就不能采用会影响靶细胞基因表达或者会刺激细胞的方法，还得获得大量高纯度、高活力的细胞。

而高亲和力抗体的使用，则不免对细胞产生刺激。

 

如果为了避免刺激细胞，不使用高亲和力抗体，细胞分选该如何进行呢？

 

无踪免疫亲和层析(TACS)细胞分选

对于这个问题，来自德国 IBA Lifesciences 的团队考虑到了亲和层析法。

进行蛋白纯化最常用的方法之一，是亲和层析法，借助标签和配体的亲和力进行蛋白纯化。纯化的重组蛋白通常能以特异性的方式被洗脱，例如，在 Strep 标签蛋白纯化中，加入生物素（biotin）即可断开 Strep 标签与配体 Strep-Tactin 的作用，达到有效洗脱的目的。得到高纯度有活性的蛋白质应用在多种下游实验中，如研究蛋白质间相互作用等。

那么是否可以以此为基础，将标签配体亲和力加以利用，结合免疫识别特性，用温和的方法得到高纯度的目的细胞呢？

 

1、「画龙点睛」的表位标签——Fab-Streps

抗体具有高度特异性，按照功能划分的抗体有 Fab 区和 Fc 区。其中的 Fab 是抗原结合片段，对特异性抗原有亲和力 (affinity)。

如果避免使用高亲和力抗体，可以考虑选取抗体上的 Fab 片段。将 Fab 与亲和 Strep 标签融合后，得到的表位标签 Fab-Streps，留有抗体-抗原相互作用，还具备标签-配体相互作用。

Fab-Streps 的 Fab 段既对目的细胞的特异性 CD 标记有着亲和力，能抓取目的细胞；Strep 段又能结合亲和层析中，固定在多种介质上的配体 Strep-Tactin，如重力柱，磁珠，荧光等，一举两得。

这样一个能应用于细胞分选的无踪免疫亲和层析方法称为 Fab-TACS (Fab-based traceless affinity cell selection)。

 

2、「无踪」label-free 的细胞分选

除了能避免使用全长抗体在分选时对细胞的刺激外，这样建立的免疫亲和层析细胞分选方法有一个重要特性， 就是分选试剂可逆，从而也避免了分选后磁珠附着在细胞上的可能。

从 Strep-tag 系统着手，充分利用了其温和可逆，高纯度的特点。这样的选后细胞表面不带「抗体标记」，为 label-free，从而避免了对下游实验的影响，如流式染色，体内、体外实验等。

3、简易的分选步骤

亲和层析法的分选细胞的步骤是怎样进行的呢？其实和蛋白纯化并无明显区别。

这里以使用重力柱的 Fab-TACS分选为例：

通过 加入 Fab-Streps-加样-清洗-洗脱，完成目的细胞的分选。洗脱步骤中，加入生物素（biotin）即可作为竞争剂断开相互作用。

Step1 加入 Fab-Streps

Step2 加入样品

Step3 清洗

Step4 洗脱

收集目的细胞

 

4、Fab-TACS 免疫亲和层析细胞分选技术优势

这样结合了抗体高特异性与层析的分选方法，具有的优点如下：

• 实验流程简单快速
• 细胞上没有试剂残留
• 选后目的细胞不受刺激
• 免去费时的离心步骤
• 可以直接从全血等其他血液样本进行分选
• 每根重力柱可处理多达 50 ml 全血
• 可根据细胞量自由搭配试剂盒

5、实验数据

当应用于 CD3 +T人/小鼠细胞分选时，实验数据为怎样呢？

实际测试之后，同样以亲和层析重力柱分选为例，从 CD3 + Fab-Streps 和 Strep-Tactin-TACS^® 琼脂糖柱中，从血沉棕黄层或鼠脾细胞中分离出 CD3 + T 细胞。 评估纯度，产率和活率。

从血沉棕黄层（A，n = 10）或鼠脾细胞（B，n = 7）中分离 CD3 +细胞。 数据平均值±SEM 表示。 通过流式细胞仪分析细胞。 富集前后的代表性 FACS 如图 C（人）和 D（小鼠）显示。 根据 DAPI 染色排除死细胞。 分离的人 CD3 + T 细胞的平均纯度为 96%，而分离的小鼠 CD3 + T 细胞的平均纯度为 91%。

分选后，人和小鼠样品中约有 85% 的 CD3 +细胞被回收。从血沉棕黄层分离后，平均有 99% 的细胞存活，鼠脾细胞样品平均有 91% 的细胞存活。

目前，IBA Lifesciences 推出的 Fab-TACS 无踪免疫亲和层析技术，提供完善的细胞分选解决方案，支持从多种的血液样品，如全血，buffy coat，PBMCs，单细胞悬液，小鼠脾脏等。提供基于荧光、磁珠、重力柱等多种形式的灵活选择，适应不同的细胞量。还能自己随心搭配想要的试剂盒，自由根据实验所需进行选择！