人源 Treg 和 Tresp 细胞分选实验

1. 分离缓冲液
   1× PBS (pH 7.2), 0.5% BSA, 2 mM EDTA 或者 6×1.5 L autoMACS^® Running Buffer – MACS^® Separation Buffer
2. T 细胞分选试剂盒
   人源 CD4+CD25+ Treg 细胞分离试剂盒 (# 130-091-301)
3. 磁选分离

• LD 分选柱，1×108 标记细胞 X1  (# 130-042-901)
• MS 分选柱，X2 (# 130-042-201)
• MidiMACS™ 分离器(适用于 LD 分选柱) (# 130-042-302)
• MiniMACS™ 分离器(适用于 MS 分选柱) (# 130-042-102)
• MACS MultiStand (# 130-042-303)
• (可选) 预分离滤器 (30 µm) (# 130-041-407)

一、磁珠标记非 CD4+ 细胞

1. 细胞计数
2. 细胞悬液 300xg 离心 10min，去上清
3. 细胞重悬，每 1×10⁷ 细胞 90ul 分离缓冲液
4. 每 1×10⁷ 细胞添加 10ul CD4+ T 细胞生物素-抗体鸡尾酒
5. 混匀，于 2-8℃ 中孵育 5min
6. 每 1×10⁷ 细胞添加 20ul 抗生物素磁珠
7. 混匀，于 2-8℃ 中孵育 10min 非 CD4+ 细胞
8. 添加分离缓冲液调整溶液体积至 500ul（注：500ul 体积中最大重悬至 1×10⁸ 细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。

二、磁珠去除非 CD4+ 细胞

• Treg 细胞分离第一步就是去除非 CD4+ 细胞。该步骤推荐使用 LD 柱，具有 1×10⁸ 标记细胞和 5×10⁸ 总细胞的细胞容量。
• 当使用 CD4+/CD25+ Treg 细胞分离试剂盒时，人源试剂盒不推荐在 LD 分选柱上处理超过 1.3×10⁸ 上样细胞总量。如果超过这个上样细胞总量，强烈推荐分离样本使用另外的 LD 分选柱。

1. 将 LD 分选柱放入 MidiMACS™ 分离器中的磁场中
2. 用 2ml 分离缓冲液冲洗分选柱，等到分选柱排空后再进行下一步操作
3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中
4. 收集通过的未标记细胞，分别用 1ml 分离缓冲液清晰柱子两次（注：收集流穿部分，这是用于进一步 Treg 和 Tresp 细胞分离所需的未标记的预富集的 CD4+ 细胞溶液）
5. 细胞计数。

三、磁珠标记 CD25+ 细胞

• 磁珠分选体积的最大初始细胞量为 1×10⁷ 细胞，更高的细胞量需要相应地提高所有体积

1. 细胞悬液 300xg 离心 10min，去上清
2. 细胞重悬，每 1×10⁷ 细胞 90ul 分离缓冲液
3. 每 1×10⁷ 细胞添加 10ul 抗生物素磁珠 Ⅱ
4. 混匀，于 2-8℃ 中孵育 15min
5. 添加 1-2ml 分离缓冲液清洗细胞，300xg 离心 10min，去上清
6. 添加分离缓冲液调整溶液体积至 500ul（注：500ul 体积中最大重悬至 1×10⁸ 细胞，对于更多的细胞数量，需要相应的提高缓冲液体积）。

四、磁珠分离 CD25+ 细胞

• Treg 和 Tresp 分选的第二步就是阳选 CD25+ 细胞。该步骤中，我们使用两个连贯的具有 1×10⁷ 标记细胞容量的 MS 分选柱。为了不超过这个容量限制，建议先通过流式细胞术测定细胞悬液中 CD25+ 细胞的浓度。
• 为了评估分离得到的 Treg 和 Tresp 细胞的纯度，必须进行细胞流式分析。有关详细实验方案，请参阅「Treg 和 Tresp 细胞的表面免疫荧光染色和细胞流式分析」。

1. 将 MS 分选柱放入 MidiMACS™ 分离器中的磁场中
2. 用 500ul 分离缓冲液冲洗分选柱
3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集含有未标记 Tresp 细胞（CD4+/CD25-）的流出溶液
4. 分别用 500ul 分离缓冲液清洗柱子 3 次，收集通过的未标记细胞和上一步所收集的溶液混合
5. 将分选柱从分离器上取下，置于合适的收集管中
6. 添加 1ml 分离缓冲液到柱子上，立即将柱塞推入柱中，冲洗出磁性标记细胞
7. 为了提高 CD4+CD25+ 细胞的纯度，洗脱的部分可以在第二个 MS 分选柱上富集（推荐）。使用新的 MS 柱重复步骤 1 至 6 中所述的磁分离操作。分离得到的 Treg 和 Tresp 细胞可以用于体外抑制分析。

1. 分选用到的最大体积为 1×10⁷ 细胞，使用少于这个量的细胞时，按照指示使用相同的体积；当使用更大的细胞量时，试剂用量和总体积都要相应扩大。例：对于 2×10⁷ 上样细胞总量,对应的试剂体积和溶液总体积都为两倍)。
2. 当使用抗凝血剂外周血或 buffycoat 时，应通过密度梯度离心分离 PBMC，例如使用 Ficoll-Paque™，收集 PBMC 样品，用于随后的流式细胞仪分析。