相对定量，你的内参选对了吗？

荧光定量 PCR 的主要用途之一是相对定量，而提到相对定量，必然离不开内参，那什么是内参基因？为什么相对定量必须使用内参？如何选择正确的内参基因？今天，我们就来聊聊关于内参的那些事。

什么是内参？

内参基因，也称为管家基因，其编码蛋白是维持细胞基本生命活动所必须的蛋白质。它的表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。管家基因高度保守且在大多数情况下持续表达，稳定表达于不同类型的细胞和组织中。

为什么相对定量必须使用内参？

那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢？我们通过以下实验案例一起了解一下。

实验目的：测定肝癌细胞 X 基因相对于正常肝细胞的表达量。通过荧光定量检测可得：肝癌细胞中 X 基因的 C_T= 25，正常肝细胞中 X 基因的 C_T= 26，所以，利用表达量倍数计算公式 2^-△CT计算，发现肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 2 倍。

但是，上面这个定量结果检测有效的前提是：必须保证两盘细胞的细胞数量完全一致；RNA 提取、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致；不存在操作误差等。这显然是无法达到的。

那如何才能使这些误差不影响 X 基因表达检测的真实性呢？

这时，为了将样本处理归一化，引入一个内参进行校正。基于前面对内参基因特点的描述，我们知道内参基因在两类细胞（正常肝细胞/肝癌细胞）中的表达量是相对一致的，所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后 X 基因的表达量。

肝癌细胞 X 基因 C_T= 25，内参基因 C_T= 20；正常肝细胞 X 基因 C_T= 26，内参基因 C_T= 22。所以，内参校正后，肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 1 / 2 倍（计算公式 2^-△△CT）。

由此可见，若想有效检测一个特定基因的相对表达情况，选择内参进行归一化处理非常重要！

如何选择合适的内参？

理想状态下的内参应在各种实验条件下，各种类型的组织和细胞中恒定表达，且表达量稳定。那是否在实验中只要选择一个常见的内参就可以了呢？

我们来看下面这个案例：

这份资料中描述了不同内参基因在不同的组织中的表达情况。以 B2M 内参基因为例，其在胎儿大脑与白细胞中的表达量相差数百倍。若使用 B2M 对胎儿大脑与白细胞中某一基因的表达量进行校准，得到结果显然是不可信的。

那如何来选择合适的内参呢？

首先，是内参的获得。常见内参获取的途径有如下三个：

途径一：通过查询相关文献，获取内参。

途径二：选择常用的多个内参进行实验验证。较常见内参基因见下图表：

途径三：通过查询 ICG 库，获取内参

网址：http://icg.big.ac.cn/index.php/Homo_sapiens

网站中搜集了文献报道的常见细胞/组织适用的内参。

如 ICG 库中收录的肺癌常见细胞系对应的内参基因有 ACTB、PPIA、PGK1。

其次，是内参的验证。选定的内参是否满足你的实验，是否在你的不同实验组中是稳定表达的呢？

我们先一起来了解下面这个案例：

该实验主要目的： NIH3T3 细胞系在无血清培养基中培养 24 h 后，添加 15% 血清，观察 8 h 内特定基因的表达量。本实验选取了两个内参基因：GAPDH 与β-2-microglobulin进行实验验证。

在不同实验组下，通过利用 2^-△CT（△C_T= C_T,_{Time x} - CT,_{Time 0}）计算得到 9 个数据，通过进行统计学分析，判定这 9 个数据差异是否显著。实验结果表明，GAPDH p＜0.0001，差异极显著，β-2-microglobulin p = 0.2345，差异不显著。说明 GAPDH 在该实验模型中表达不稳定，不建议将 GAPDH 作为该实验的内参。

通过这个案例可以知道，验证内参时，其一、尽可能选用多个内参同时进行实验；其二、通过在不同样本处理上的表达差异检测情况，来选择合适的内参。

综上所述，在相对定量检测中，最重要的是选择合适的内参基因；而选择合适的内参基因中，最重要的，则是实验内参基因在不同处理间的表达稳定性。选择合适的内参，是相对定量成功的开端！