材料与仪器
血清
E.coli phagelysate TBST NZY agar plates MgSO4 IPGT TBS BCIP-NBT SM buffer chloroform LB培养基
nitrocellulose membranes 滤纸 恒温培养箱 -80℃低温储藏箱 分光光度计 低温离心机 恒温水浴锅 镊子
E.coli phagelysate TBST NZY agar plates MgSO4 IPGT TBS BCIP-NBT SM buffer chloroform LB培养基
nitrocellulose membranes 滤纸 恒温培养箱 -80℃低温储藏箱 分光光度计 低温离心机 恒温水浴锅 镊子
步骤
一、E.coli/phage裂解液预吸附血清
1. 将E.coli /phage lysate 以1:10-20 稀释在TBST 溶液中。
2. 将4 张82mm 的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的E.coli/ phagelysate 中，室温下水平摇动30 分钟，取出NC 并使膜沥干。
3. 用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分钟。
4. 用滤纸轻轻吸去膜上的液体。
5. 将膜放入50ml 封闭液中，室温下水平摇动最少30 分钟。
6. 将膜从封闭液中取出，用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分钟。
7. 将血清按1:5 稀释在TBST 溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平摇动10 分钟。
8. 从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇10 分钟.
9. 重复步骤8，直至所有4 张膜都处理完。
10. 除去最后一张膜，收集血清（prima ry antibody），分装成小份储存于-80℃冰箱中待用。
注意：该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反应的抗体，这样可以减少假阳性率；一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于4℃作短暂保存；可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少10个病人血清进行混合；
来源：丁香实验
