PCR与新基因克隆

关于新基因的克隆，有几种方法，其中关于PCR的有：
1．简并引物PCR法
根据编码氨基酸的密码子的摇摆性，将编码一种氨基酸的多个密码子并列设计成一组引物进行PCR扩增，适用于克隆已知氨基酸序列的基因、某基因家族的新成员和不同物种的同源基因。可根据氨基酸序列推测核酸序列，或根据基因家族已知成员的核酸序列，选其保守区或相对保守区设计简并引物，然后用PCR法从一定组织的cDNA文库中扩增目的基因。该法结合3’RACE（rapid amplification of cDNA end）和5’RACE可以得到全长的cDNA。PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中往往呈弥散状，需根据目的基因的预计大小，或Southern杂交结果回收PCR产物，然后克隆测序。初步得到的克隆多数为EST，要根据生物信息学分析的结果判断是否是目的基因的EST，如是，下一步可用RACE法克隆全长cDNA。

2.锚定引物PCR法
该法是得到全长cDNA较简便的方法。但要求提取高质量的mRNA，要尽量纯净和完整。在反转录时，在cDNA的两端分别加上一段24-27个核苷酸的接头。随后用这个接头作为引物扩增cDNA，然后克隆测序。该法的优点是简便、较易得到全长的cDNA；缺点是随机性强，目的性差，对RNA要求高，如接头与基因本身有同源性就不易得到全长cDNA。
3.差示PCR法
1992年梁鹏等人创建了差异显示PCR（differentially display RT-PCR, DDRT-PCR）方法[25]，也是利用组织细胞间基因表达的差异来筛选新基因，为近几年应用较广的克隆新基因的方法。其原理为，从两种或两种以上待比较组织中提取总RNA作为模板，用数条5’端武断引物和3’锚定引物随机组合进行PCR扩增，并在扩增过程中参入同位素，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后放射自显影。根据X光片上cDNA 条带的差异，从胶中回收差异条带，并用相同的引物进行第二次扩增，以获得足量PCR产物制备探针，用于Northern或反向Northern杂交，证实差异条带的可靠性。经证实的差异条带可进一步克隆、测序及生物信息学分析，再决定是否进行全长cDNA的克隆。该法的优点是快速，RNA用量不，可同时比较两种以上组织细胞的差异。其缺点是：①假阳性多，可高达70%；②对高丰度表达的基因有偏向性，低丰度片段很难获得；③获得的片段太短，多为300bp左右，且靠近3’端