分 选 前 标 本 制 备

分 选 前 标 本 制 备

M A C S 技术可以使用的细胞来源很广泛，包括人类的外周血、骨髓、脐带血、冷冻保存的外周血和骨髓、淋巴结、扁桃腺、肿瘤组织、体腔液，小鼠的脾脏、骨髓、胎肝、胸腺、淋巴结，其他动物以及其他种类的细胞 (如培养细胞、大脑细胞、皮肤细胞等)。由于细胞团块和死细胞的存在一方面会堵塞分选柱，降低分选效率，另一方面会与磁珠非特异性结合，造成分选后细胞纯度降低。因此分选前的标本制备是一个很重要的环节。标本制备方法主要包括密度梯度离心、组织消化法 (机械分离、生物化学分离）过滤、裂解红细胞。

密 度 梯 度 离 心

密度梯度离心是最常用的标本制备方法，使用的试剂主要有 Ficoll 液 和 Percoll 液 。

具体方法参见 1.1 节 。

组 织 消 化 法 ( 机 械 分 离 、 生 化 分 离）

组织标本的 MACS 分选中，一个很重要的问题就是如何成功获得单细胞悬液。操作中可能会用到机械分离和酶分离方法，前者包括切割和钢网研磨，后 者 包 括 ( 如 黏附的培养细胞) 和酶 (胰蛋白酶、胶原酶、解离酶) 消化方法。做酶消化时要考虑到是否会损坏用来做磁性标记的细胞表面抗原。如果标本中含有大量死细胞，则需要使用含有D N A 酶的缓冲液。具体方法参见 1.5 节 。

以胶原酶 D 处理小鼠脾细胞为例：

⑴ 在 直 径 6c m 的平皿内加入足以覆盖底部的胶原酶 D(大约 5 ml)，把小鼠脾脏放入平皿中。

(2) 使 用 Im l 注射器和 25 G 针 头 将 5 0 0 4 胶 原 酶 D 注入小鼠脾脏。

(3) 用剪子和镊子将小鼠脾脏剪成小片。

(4)3 7 1 条件下将小鼠脾脏碎片在 5m l 胶 原 酶 D 中孵育 45〜 60 min。

(5) 将剩余的组织和胶原酶 D 消化的细胞在钢网上研磨过滤。

(6) 将所有细胞收集在 50m l 试管中，计数。加入缓冲液直至终体积为 15 ml， 200 g离 心 lOmin，用生理盐水或 PBS 洗涤细胞。

(7) 小心地去除上清，按照说明书调整体积。

过滤

为了去除组织团块和黏附成团的细胞，得到单细胞悬液，需要进行过滤 。 一 般血细胞大小为 7——20Um，因此建议在分选前使用 30um(400 目左右) 滤网对标本进行过滤。

裂 解 红 细 胞

(1) 在 1 倍体积的细胞悬液中加入 5——1 〇倍体积的红细胞裂解缓冲液，室温下孵育5 min

(2) 20℃、 3oog 离 心 IOmin，小心地去除上清。

⑶ 加 入 缓 冲 液 洗 涤 2 次 ， 2 0 ℃ 、 200 g 离 心 lOmin，小心地去除上清。

(4) 在适当的缓冲液内重悬细胞，计数并进行磁性标记