流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。

在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。

在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检测方法：

线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。

Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。

下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果，横坐标是Annexin-V FITC，纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。

在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。G2-M期DNA含量是G0-G1的两倍，而S期介于两者之间。

但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0-G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0-G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0-G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。