保持清洁：关注微生物组研究中的污染

过去的十年见证了DNA测序技术的惊人发展。从这些进步中受益匪浅的一个领域是微生物学领域，因为现在有可能以以前难以想象的深度来描述微生物群落(“微生物群”)。

因此，微生物群的研究目前正在蓬勃发展，由许多最近大规模的、全球性的项目领导，如人类微生物群项目、MetaHIT和地球微生物群项目，这些项目利用测序的力量试图了解微生物群落是如何影响它们周围的环境的。

与人类有关的微生物群落，例如存在于肠道、口腔和阴道中的微生物群落，特别值得关注，因为众所周知，我们的微生物伙伴可以以许多不同的方式影响健康。因此，基于序列的微生物群分析已被应用于宿主相关生境的整个范围，希望这些敏感技术能够识别与疾病相关的微生物因子。

这包括来自体内通常“无菌部位”(如血液或脑脊液)的低生物量微生物种群。这些地方之所以有趣，正是因为那里生活的东西太少了，所以稀疏的细胞可能无法被其他方法探测到。

污染

新测序技术的敏感性带来的一个潜在问题是，这意味着样品处理过程中可能引入的微量污染DNA也更容易观察到，而这些可能很难与样品中的“真正”细菌区分开来。对于含有少量细菌的样本(例如，血液样本，皮肤拭子，肺灌洗液)，DNA的污染可能会淹没我们真正感兴趣的微生物的DNA。

多年来，我们对阴性对照进行了测序，仅由实验室使用的试剂组成，没有添加样本模板，与人类微生物群研究一起，在测序结果中经常发现不同程度的污染环境细菌。这些包括土壤和水的居民，如Ralstonia，缓生根瘤菌，草本菌，假单胞菌和伯克霍德氏菌。我们认为它们起源于DNA提取试剂盒或PCR试剂，更早的出版物也证实了在其他地方也观察到了这种现象。

最近，我们还看到了一些描述来自低生物量环境的细菌的出版物，这些与我们之前在阴性对照中观察到的污染物相似的细菌被强调为重要的(例如，引起疾病)。

通常不清楚这些研究中是否包括阴性测序对照，或者是否做过污染检查。有时这些出版物会被反驳，比如一种与血清阴性肝炎有关的新型病毒，它实际上来自于一种实验室试剂盒成分。

因此，我们决定通过培养bongori沙门氏菌并进行稀释序列来确定“纯”样本的序列。如果没有污染，那么无论样本有多稀，我们都只能观察到一种物质。然而，如果存在污染，我们想知道是否存在一个临界点，即污染物DNA的背景浓度超过了实际的bongori含量。

为了排除污染问题局限于单一的DNA提取试剂盒制造商的可能性，我们用四个不同制造商的试剂盒从稀释系列中提取DNA并进行比较。

低生物量微生物组样品特别容易受到影响

在我们的研究结果中，我们不仅检测到了bongori菌，还发现了大量不同种类的污染细菌，其中许多来自土壤/水，但也有一些皮肤菌落。样品越稀释(即加入的细菌数量越少)，测序结果越以污染为主。

被污染的DNA在稀释后的样本中占主导地位，这些样本每毫升或更少含有大约1万到1000个bongori细胞。这实际上是相当多的细菌，这表明尽管污染问题对低生物量的样本来说特别严重，但它也可以适用于其他很多样本。

然后，我们通过对鼻咽样本中细菌序列调查的结果进行研究，证明了污染可能对真实微生物群数据集产生的影响。我们能够证明，虽然我们认为我们最初观察到了一个生物学上有趣的模式，但这种模式实际上是由不同批次的DNA提取试剂盒之间的不同污染细菌造成的。

结论

我们认为，最重要的结论是做好应对DNA污染的准备。在实验初期就预料到，远比在实验结束时才在数据中发现生物学上意想不到的细菌要好得多。

通过采集和测序大量的对照样品(存储介质对照、提取试剂盒对照、PCR对照等)，如果在样品处理过程中出现任何污染，将在序列数据中出现污染的证据，可能会筛选出有害的类群(适当谨慎)。或者，也可以使用UV处理、酶或其他方法从一些试剂中去除DNA。

更大的理解问题的深度测序DNA污染的微生物群的研究我们希望它还将提高鲁棒性的研究,涉及疾病的意想不到的物种,例如,需要证明确实存在于样本而不是依靠遗传孤立地痕迹。

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