保持清洁：微生物研究中的污染问题

过去的十年见证了DNA测序技术的惊人发展。从这些进步中获益良多的一个领域是微生物学，因为现在可以在以前无法想象的深度描述微生物群落(“微生物群”)。

因此，微生物区系研究目前正在蓬勃发展，由许多最近的大规模、世界性的项目领导，如人类微生物组项目、MetaHIT和地球微生物组项目，这些项目利用测序的力量试图了解微生物群落如何影响它们周围的环境。

与人类相关的微生物群落，如肠道、口腔和阴道内的微生物群落，尤其值得关注，因为众所周知，我们的微生物伙伴可以以许多不同的方式影响健康。因此，基于序列的微生物区系分析已经应用于一系列宿主相关的栖息地，希望这些敏感技术能够识别与疾病相关的微生物制剂。

这包括来自体内通常“无菌场所”(如血液或脑脊液)的低生物量微生物种群。这些地方之所以有趣，恰恰是因为里面几乎没有什么生物，所以稀疏的细胞可能无法通过其他方式探测到。

污染

新测序技术的一个潜在问题是，它意味着在样品处理过程中引入的微量污染DNA也更容易被观察到，而这些可能很难与样品中的“真正”细菌区分开来。对于含有少量细菌的样本(例如，血液样本、皮肤拭子、肺灌洗)，污染的DNA可能会淹没我们感兴趣的实际微生物的DNA。

多年来，我们对阴性对照进行了测序，只使用了实验室中使用的试剂，没有添加样品模板，同时进行了人体微生物菌群研究，并在测序结果中发现了不同程度的污染环境的细菌。这些包括土壤和水的居民，如Ralstonia，缓生根瘤菌，Herbaspirillum，假单胞菌和伯克霍尔德菌。我们认为它们起源于DNA提取试剂盒或PCR试剂，较早的出版物也证实在其他地方也观察到了这一现象。

最近，我们还看到了一些描述来自低生物量环境的细菌的出版物，在这些环境中，与我们以前在阴性对照中观察到的污染物类似的细菌被强调为重要的(例如，引起疾病)。

通常不清楚这些研究中是否包括负序对照，或是否做过任何污染检查。有时这些出版物被驳倒，例如在一个与血清阴性肝炎相关的新病毒的案例中，它实际上来自一个实验室试剂盒成分。

因此，我们决定通过培养bongori沙门氏菌并进行一系列稀释来对“纯”样本进行测序。如果没有污染，那么不管样本有多稀，我们只会观察一个物种。然而，如果有污染，我们想知道是否有一个临界点，在这个临界点上，污染物DNA的背景水平占主导地位，超过了实际的S. bongori含量。

为了排除污染问题局限于单个DNA提取试剂盒制造商的可能性，我们从四个不同制造商的试剂盒中提取了稀释系列的DNA，并对它们进行了比较。

低生物量微生物样本特别敏感

在我们的研究结果中，我们不仅发现了S. bongori，还发现了大量种类繁多的污染细菌，其中许多来自土壤/水，但也有一些来自皮肤的定植者。样品稀释越多(即添加的细菌生物量越少)，污染对测序结果的影响越大。

污染物DNA在每毫升含有大约10000 - 1000个S. bongori细胞的稀释样品中占主导地位。这实际上是相当多的细菌，表明虽然污染问题对低生物量样品来说特别严重，但它也适用于许多其他的样品。

然后，我们通过对鼻咽样本中细菌的序列调查结果的研究，证明了污染可能对真实的微生物群数据集产生的影响。我们能够证明，尽管我们认为我们最初观察到的是一种生物学上有趣的模式，但这种模式实际上是由不同批次的DNA提取试剂盒中不同的污染细菌造成的。

结论

我们认为，最重要的结论是为DNA污染做好准备。在实验的早期就预料到细菌的存在，要比在实验结束时才在数据中发现生物学上意想不到的细菌好得多。

通过收集和测序大量的对照样品(储存介质对照、提取试剂盒对照、PCR对照等)，如果在样品处理过程中发生污染，序列数据中会有污染的证据，可能会筛选出有问题的类群(适当谨慎)。另外，也可以使用紫外线处理、酶或其他方法从一些试剂中去除DNA。

更大的理解问题的深度测序DNA污染的微生物群的研究我们希望它还将提高鲁棒性的研究,涉及疾病的意想不到的物种,例如,需要证明确实存在于样本而不是依靠遗传孤立地痕迹。

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