保持清洁：微生物研究中的污染焦点

今天发表在《BMC生物学》上的一项研究发现，许多发表的微生物组学研究可能受到了污染。在这篇客座文章中，论文作者苏珊娜·索尔特和艾伦·沃克向我们详细介绍了他们的发现。

在过去的十年里，DNA测序技术有了惊人的发展。从这些进展中受益匪浅的一个领域是微生物学领域，因为现在可以描述以前难以想象的深度的微生物群落（“微生物群”）。

因此，微生物群落研究目前正在蓬勃发展，由最近许多大规模的、世界范围的倡议，如人类微生物群项目、MetaHIT和地球微生物群项目所领导，它们利用测序的力量试图了解微生物群落如何影响其周围环境。

与人类相关的微生物群落，如存在于肠道、口腔和阴道中的微生物群落，是人们特别感兴趣的，因为众所周知，我们的微生物伙伴可以通过许多不同的方式影响健康。因此，基于序列的微生物群落分析已经应用于一系列与宿主相关的栖息地，希望这些敏感的技术能够识别与疾病相关的微生物制剂。

这包括来自身体中通常“无菌部位”的低生物量微生物种群（如血液或脑脊液）。这些站点之所以有趣，正是因为它们几乎没有（如果有的话）生命存在，所以稀疏的细胞可能无法通过其他方式检测到。

污染

新测序技术灵敏度的一个潜在问题是，这意味着在样品处理过程中可能引入的微量污染DNA也更容易观察到，而且这些可能很难与样品中的“真实”细菌区分开来。对于含有少量细菌（例如，血液样本、皮肤拭子、肺部灌洗液）的样本，污染DNA可能会淹没我们感兴趣的实际微生物的DNA。

多年来，我们对阴性对照品进行了测序，仅由实验室使用的试剂组成，没有添加样品模板，同时进行了人类微生物群研究，在测序结果中经常发现不同程度的污染环境细菌。其中包括土壤和水的居民，如拉尔斯顿菌、缓生根瘤菌、草螺菌、假单胞菌和伯克霍尔德菌。我们相信它们起源于DNA提取试剂盒或PCR试剂，而较旧的出版物也证实在其他地方也观察到了这一点。

最近，我们还看到一些出版物描述了来自低生物量环境的细菌，其中与我们之前在阴性对照中观察到的污染物相似的细菌被强调为重要的（例如，引起疾病）。

通常不清楚这些研究中是否包括阴性测序对照，或者是否进行了污染检查。有时这些出版物会遭到驳斥，比如一种与血清阴性肝炎有关的新型病毒，它实际上来自实验室试剂盒组件。

因此，我们决定对一个“纯”样本进行测序，方法是培养邦戈里沙门氏菌并进行稀释。如果没有污染，那么无论样本稀释到什么程度，我们都只能观察到一个物种。然而，如果存在污染，我们想看看是否存在一个临界点，即污染DNA的背景水平在实际的S.bongori含量中占主导地位。

为了排除污染问题仅限于单个DNA提取试剂盒制造商的可能性，我们使用四个不同制造商的试剂盒从稀释系列中提取DNA并进行比较。

低生物量微生物群样品特别容易受到影响

在我们的研究结果中，我们不仅发现了S.bongori，还发现了各种各样的污染细菌，其中许多来自土壤/水，还有一些皮肤殖民者。样品越稀释（即添加的细菌生物量越低），污染对测序结果的影响越大。

污染物DNA占主导地位的稀释样品中含有约100000至100.BangRi细胞每毫升或更少。这实际上是相当多的细菌，表明虽然污染问题是特别严重的低生物量样品，它可以适用于许多其他。

然后，我们通过研究鼻咽样本中细菌的序列调查结果，证明了污染对真实微生物群数据集的影响。我们能够证明，虽然我们认为我们最初观察到了一种生物学上有趣的模式，但这种模式实际上是由不同批次DNA提取试剂盒之间的不同污染细菌造成的。

结论

我们认为，最重要的结论是要做好应对DNA污染的准备。在实验的早期预测要比在实验的最后从数据中发现生物学上意想不到的细菌要好得多。

通过收集大量的对照样品（存储介质对照、提取试剂盒对照、PCR对照等）并对其进行测序，如果在样品处理过程中发生任何污染，序列数据中将有证据表明污染，并且可以筛选出有问题的分类群（适当谨慎）。或者，可以使用紫外线处理、酶或其他方法从某些试剂中去除DNA。

随着对深测序微生物群研究中DNA污染问题的进一步理解，我们希望它也能提高研究的稳健性，例如，在疾病中牵连的意想不到的物种将需要被证明在样本中确实存在，而不是孤立地依赖于遗传痕迹。