微量组织/细胞 DNA 提取

从微量样本中提取 DNA。微量样本包括：微量血液样本，如低至 1 μl 全血；微量细胞样本，可低至 100 个细胞，如显微切割细胞、流式分选细胞等；或小于 10 mg 组织，如穿刺样本、活检样本；以及骨骼或化石等疑难样本。

QIAamp 系列基于 QIAGEN 经典的硅胶膜柱技术，细胞裂解后释放出核酸并进行蛋白消化，将核酸溶液转移到硅胶膜柱上使 DNA 结合在柱膜上，经洗涤去除杂质后洗脱得到 DNA。

QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)

离心机

加热模块或水浴锅

1.5 ml 或 2 ml 离心管、无菌吸头

一次性手套

乙醇（96%–100%）

提取显微切割样本中 DNA 的基本过程可分为如下几步：

（一）准备工作与溶液配置

准备工作：

1、将样本平衡至室温（15°C–25°C)；

2、将用于洗提的 Buffer AE 或者蒸馏水平衡至室温；

3、将 thermomixer 或旋转加热孵育装置加热至 56°C 以备第 3 步使用。如果没有以上设备，可以用加热模块或者水浴装置代替；

4、如果 Buffer AL   和 Buffer ATL 有沉淀，可加热至 70°C   并温和晃动使其溶解；

5、配置好 Buffers AW1   和 AW2；

溶液配置：

1、AW1：加入 25 ml   乙醇（96%–100%) 至装有 19 ml Buffer AW1   浓缩液的瓶中。在加过乙醇的瓶子外贴好标签。配好的溶液可以在室温（15℃–25°C) 下储存 1 year。

2、AW2：加入 30 ml   乙醇（96%–100%) 至装有 13 ml Buffer AW2   浓缩液的瓶中。在加过乙醇的瓶子外贴好标签。配好的溶液可以在室温（15℃–25°C) 下储存 1 year。

注意：在操作前，须振荡混匀。 

（二）DNA 提取

1、加 15 μl Buffer ATL 至显微切割样本中（显微切割样本预先收集在 0.2 ml 的离心管中）；

2、加入 10 μl proteinase K，并间歇涡旋振荡 15 s 混匀；

3、将 0.2 ml   的微型离心管放在 thermomixer 或旋转加热孵育装置上，56°C 孵育 3 h（如果是福尔马林固定的组织，需要孵育 16 h），期间需要偶尔振荡。孵育时间视样本的量可做调整。

4、加入 25 μl Buffer ATL；

5、加入 50 μl Buffer AL，盖上盖子，间歇涡旋振荡 15 s 充分混匀。为了确保充分裂解，须将样本同 Buffer AL 充分混匀成均质溶液；

6、加入 50 μl 乙醇（96%–100%)，盖上盖子，间歇涡旋振荡 15 s 充分混匀。室温（15℃–25°C）下孵育 5 min。（注意：如果室温超过 25°C，先将乙醇在冰上预冷后加入管内）；

7、短暂离心以去除粘在管盖上的液滴；

8、将离心后的所有液体小心转入 QIAamp MinElute column（柱子装在一个 2 ml   的收集管里），避免碰到管口边缘。盖上盖子，6000 x g (8000 rpm) 下离心 1 min。将柱子转至一个新的 2 ml   的收集管，将旧的收集管和流出液一起丢弃。如果柱上有残留，用更高速度离心，直至柱上无残留。

9、小心打开盖子，在柱上加入 500 μl Buffer AW1，小心不要碰到管口边缘。盖上盖子，6000 x g (8000 rpm) 下离心 1 min。将柱子转至一个新的 2 ml 的收集管，将旧的收集管和流出液一起丢弃。

10、小心打开盖子，在柱上加入 500 μl Buffer AW2，小心不要碰到管口边缘。盖上盖子，6000 x g (8000 rpm) 下离心 1 min。将柱子转至一个新的 2 ml 的收集管，将旧的收集管和流出液一起丢弃。须避免柱子接触到流出液。

11、全速离心（20,000 x g; 14,000 rpm) 3 min，彻底干燥柱膜。这一步是必需的，因为乙醇残留于洗提液中会影响到后续研究。

12、将柱子装在一个新的 1.5 ml 的离心管（未提供）中，丢弃含有流出液的收集管。小心打开盖子，加入 20–100 μl Buffer AE 或者蒸馏水于膜的中央。如果高的 pH 值或者 EDTA 含量会影响到下游研究，就用水来洗涤。

注意：确保 Buffer AE 或蒸馏水在室温（15℃–25°C）下平衡。

13、盖上盖子，室温（15℃–25°C）下孵育 1 min。全速（20,000 x g; 14,000 rpm）离心 1 min。（如果在离心前，室温下孵育５min，将会有助于提高 DNA 的产量）

1、所有离心步骤在室温下进行（15°C–25°C)

2、如果纯化 DNA 的样本细胞非常少，需要使用 carrier RNA

Carrier RNA 的使用：

1、在 Buffer AL 中加入 Carrier RNA

2、为了从微量样本中纯化 DNA（例如，血样低于 10 μl），我们建议在 Buffer AL 中加入 carrier RNA 。对于足量的 DNA 样本，这一操作是非必须的。在装有 310 μg 冻干 carrier RNA 的管子中加入 310 μl Buffer AE，得到 1 μg/μl 的溶液。充分溶解后，分装冻存于–20°C 。不要反复冻融超过 3 次。

3、依照对应试剂盒说明，计算每个样本所需 Buffer AL 和 carrier RNA 的量，乘以处理的样本数，即可知道每次使用的 Buffer AL 和 carrier RNA 的量。将吸取误差考虑在内，每次可多计算 2 个样本的量。

4、正反倒置管子 10 次，温和混匀 Buffer AL 和 carrier RNA。为了避免产生气泡，请不要涡旋振荡。注意，carrier RNA 不是溶解在 Buffer AL 中。必须先溶解在 Buffer AE 里，在使用的时候再加入到 Buffer AL 中。加了 carrier RNA 的 Buffer AL 可在室温（15°C–25°C) 下稳定 48 h 。

内容来源： QIAGEN 凯杰