微量 RNA 建库测序方案

RNA 测序 (RNA Sequencing，简称 RNA-Seq) ，是基于高通量测序技术的转录组学研究方法，可以快速对基因组中的 RNA 种类和数量进行分析，揭示特定生物学或疾病发生过程中的分子机制。RNA 文库制备通常需要 100 ng 以上的起始 RNA，然而实际的科研实验中常会遇到样本本身较少或类型特殊，导致 RNA 起始量不足的情况，给建库实验带来极大的挑战。本章内容我们将为大家介绍微量 RNA（单细胞或低至 10 pg RNA）的特殊建库方案。

针对单细胞/微量细胞（1-1000 cells）转录组测序，目前使用的是 SMART 扩增技术。

具体步骤及反应原理如下：

1、使用 oligo dT 针对 RNA 聚合酶 II 转录的 RNA（具有 polyA 结构）进行逆转录（从而避开 rRNA）； 

2、逆转录到 5 cap 的时候，逆转录酶的末端转移酶活性会不依赖于 RNA 模板， 在 cDNA 的末端加上多个 C（一般是 3 个）；

3、然后使用一个带有 GGG 的接头（图中的 TS oligo）与 CCC 进行配对，利用逆转录酶的 template switch 特征，继续以这个 TS oligo 为模板合成 DNA。这样 cDNA 的 3』就会加上 TS oligo 的序列；

4、进而以 TS oligo 配对的引物，对这个 cDNA 分子进行扩增。通过此方式，就可以将全长 RNA 进行指数扩增；

5、然后对扩增获得的 DNA 分子进行文库构建、测序及数据分析。

QIAseq UPX 3' Transcriptome Kit (QIAGEN，低至单细胞或 10 pg RNA 的 3' RNA-seq 建库试剂盒）

QIAseq UPXome RNA Lib Kit (QIAGEN，低至 500 pg RNA 全转录组建库试剂盒，下文实验步骤基于此试剂盒）

1.5 ml 或 2 ml 离心管、无菌吸头

一次性手套

乙醇（96%–100%）

纯化磁珠与磁力架

离心机

Vortex 漩涡震荡仪

PCR 仪

1．按表 1 准备 rRNA 去除反应体系，轻微震荡混匀。

2．按表 2 进行反应：

3．按表 3 准备 cDNA 合成反应体系，轻微震荡混匀。

4．将 cDNA 合成反应组分加入到 SID-TS-96S 孔板中，轻微震荡混匀并离心。

5．按表 4 进行反应：

6．合成后的 cDNA，可以选 8—24 个放于 1 个 2 ml 离心管中，多个 cDNA 可以混合构建一个文库。

7．加入 1.1X 体积的 QIAseq beads 对 cDNA 产物进行纯化。

8．室温孵育 5min

9．将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清（约 2min），小心移去上清。

10．将反应管放置于磁力架上，加入 200 μl新鲜配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干扰磁珠。

11．重复第 14 步的乙醇洗涤一次。

12．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠过度干燥可能会导致 DNA 产量降低。

13．使用 22μl 的无核酸酶水来重悬磁珠，将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。

14．向每个样本中加入 22μl（1.1X）重悬后的磁珠。重复第 8-12 步。使用 25 μl 的无核酸酶水来重悬磁珠，将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清，小心吸取 23 μl 的上清至新的 PCR 板中。

15．按表 5 步骤进行 PCR 仪（需带有热盖）程序设定

16．按表 6 设置 PCR 循环反应，PCR 循环数参考表 7。

17．加入 40 μl磁珠进行纯化，室温孵育 5min

18．将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清（约 2min），小心移去上清。

19．将反应管放置于磁力架上，加入 200 μl新鲜配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干扰磁珠。

20．重复第 19 步的乙醇洗涤一次。

21．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠过度干燥可能会导致 DNA 产量降低。

22．使用 22μl 的无核酸酶水来重悬磁珠，将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。

23．向每个样本中加入 16μl（0.8X）重悬后的磁珠。重复第 18-22 步。使用 24 μl 的无核酸酶水来重悬磁珠，将反应管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液体变澄清，小心吸取 22 μl 的上清至新的 PCR 板中。纯化后的文库可保存在-20°C 直至测序。

1. SMART 技术的转录酶具有末端转移酶活性，单管反应一步完成逆转录和二链合成，不需要额外的 cDNA 纯化和二链合成反应，简化了建库流程并节省了操作时间。

2. 微量建库测序能否成功，在实验方面一个重要的因素就是降低核糖体在 Total RNA 中的比例。使用 polyT 引物反转录虽然能避免 rRNA，但是很难获得全长 RNA 数据。本方案结合了 rRNA 去除「黑科技」QIAseq FastSelect，整个 rRNA 去除反应完美融入逆转录步骤中，无需任何操作以及额外纯化步骤。这一「黑科技」可将总 RNA 中的 rRNA「封闭」住，使其不能进行反转录、二链合成等反应，最终无法进入构建好的 NGS 文库，显著降低 rRNA 干扰，减少测序成本的同时降低数据分析难度并提高结果的准确性。且这一方法不受起始样本量限制，低至单细胞裂解释放的 RNA 都可以进行 rRNA 去除。

3. 当 RNA 起始量较低时，测序所需的数据量也不必过高，每个样本单独构建文库既浪费建库试剂，又增加了操作时间。本方案支持 8—24 个 cDNA 混合建库，只要将不同样本反转录得到的 cDNA 混合纯化，构建一个混合 RNA-seq 文库即可。高通量测序后，根据反转录时引入的样本标签（Sample ID）拆分出每个样本的基因表达信息即可，节省成本的同时也提高了实验效率。

内容来源：QIAEEN 凯杰