微量组织/细胞 RNA 提取

从微量样本中分离 RNA，微量样本包括：微量细胞样本如低至 1 个细胞、流式分选细胞（FACS）样本；微量组织样本如低于 2 μg 的组织样本如穿刺样本（FNA）、激光显微切割（LMD）样本等。

 

B 图的结果显示，即使是单个细胞提取的 RNA，依然可以检测到 β-actin 相对应的 CT 值，且随着细胞数量的增加，相对应的 CT 值也随之表现更好。

RNeasy 系列基于 QIAGEN 经典的硅胶膜柱技术，首先采用了环保无毒的增强型裂解液 Buffer RLT 进行细胞裂解，在让细胞快速破碎完全释放 RNA 的同时，也能抑制 RNase 酶活性避免 RNA 被降解，相关操作更加安全、简便，无需担心因传统酚氯仿方法中的「分层吸液失误」而导致的实验失败，随后仅需加入乙醇并转移到硅胶膜柱上，使 RNA 与硅胶膜高效结合。经过洗涤后，洗脱得到高纯度 RNA。

 

RNeasy Micro Kit (QIAGEN)

14.3 Mβ-巯基乙醇（β-ME）或 2 M 二硫苏糖醇（DTT）的水溶液

乙醇（70% 和 96%—100%）~K~Hp~M~1~Kp~M无菌、无 RNase 的枪头

离心机（带转子，适用于 2 ml 试管）

涡旋仪器

一次性手套

RNA 稳定试剂：

• 细胞样本：RNAprotect 细胞试剂或液氮；

• 组织样本：RNAprotect 组织试剂（仅稳定 RNA）、Allprotect 组织试剂（稳定 DNA、RNA 和蛋白质）或液氮；

样品破碎和均质化设备，根据所选方法选择使用：

• 胰蛋白酶和 PBS；

• QIAshredder 均质机；

• 钝头针头和注射器；

• 研钵和杵；

• TissuerRuptor Ⅱ，带 Tissuerruptor 一次性探头；

• TissueLyser Ⅲ；

用于彻底去除 gDNA 的 RNase-Free DNase Set。

用于从心脏、肌肉和皮肤组织中纯化 RNA，需要用到：

• QIAGEN 蛋白酶 K（>600 mAU/ml，溶液）；

• 可达到 55°C 的加热块或水浴；

细胞样本

1. 可将悬浮培养或单层生长的细胞收取或直接裂解细胞。对于组织样本，新鲜采集的组织样本、冻存样本或保存在保护液中的样本，确定组织不要使用超过 5 mg。

2. 加入缓冲液 RLT 裂解细胞。

添加 350 μl 缓冲液 RLT（如果处理细胞低于 1 x 105，则添加 75 μl 缓冲溶液 RLT）。涡旋或移液器混合。

3. 使裂解物均质化。

4. 向裂解液中加入 1 倍体积的 70% 乙醇，用移液器充分混合。不要离心。立即执行步骤 5。

5. 将样品（包括可能形成的任何沉淀物）转移到放置在 2 ml 收集管中的 RNeasy MinElute 硅胶膜柱中。轻轻盖上盖子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度离心 15 s。丢弃流出液。

6. 向 RNeasy MinElute 硅胶膜柱中加入 350μl 缓冲液 RW1。轻轻盖上盖子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度离心 15 s，清洗硅胶膜柱。丢弃流出液。

可选：如果不需要柱上 DNA 酶消化，则加入 700 μl 缓冲液 RW1，在 ≥ 8000 x g 下离心 15 s，然后丢弃流出液和收集管。_继续执行步骤 10。

7. 将 10μl DNase I 储备溶液加入 70 μl 缓冲液 RDD 中。轻轻翻转试管进行混合。

8. 将 DNase I 孵育混合物（80μl）直接加入 RNeasy MinElute 硅胶膜柱中，并放置（20-30°C）15 min。

9. 向 RNeasy MinElute 硅胶膜柱中加入 350μl 缓冲液 RW1。轻轻盖上盖子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度离心 15 s，清洗硅胶膜柱。丢弃流出液和收集管。

10. 将 RNeasy MinElute 硅胶膜柱放入新的 2 ml 收集管中。向硅胶膜柱中加入 500 μl 缓冲液 RPE。轻轻盖上盖子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度离心 15 s，清洗硅胶膜柱。丢弃流出液。

11. 向 RNeasy MinElute 硅胶膜柱中加入 500μl 80% 乙醇。轻轻盖上盖子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度离心 2 min，清洗旋硅胶膜柱。丢弃流出液和收集管。

注意：离心后，小心地从收集管中取出 RNeasy MinElute 硅胶膜柱，使柱不接触流出液。否则会出现乙醇残留。

12. 将 RNeasy MinElute 硅胶膜柱放入新的 2 ml 收集管中。打开硅胶膜柱的盖子，全速离心 5 min。丢弃流出液和收集管。

干燥硅胶柱膜很重要，因为残留的乙醇可能会干扰下游反应。打开盖子进行离心，确保 RNA 洗脱过程中无乙醇残留。

13. 将 RNeasy MinElute 硅胶膜柱放入新的 1.5 ml 收集管中。将 14μl 无 RNase 的水直接添加到硅胶膜的中心。轻轻盖上盖子，全速离心 1 min 以洗脱 RNA。

注意：不要用少于 10 μl 的无 RNase 水洗脱。

 

1. 如采样后不能立即开展 RNA 提取实验，可使用 RNA protect 保护液稳定样本中的 RNA。

2. 当样本为低于 500 个细胞或低于 2 μg 的组织时，建议在细胞裂解液中加入适量的 Carrier RNA，增加总 RNA 的回收率。

3. 如果样本含有高浓度的 RNase, 或是组织样本， 请把 10μlbeta 巯基乙醇或 20 μl 2M DTT 加到 1 ml RLT 裂解液里。此混合液可在室温收藏 1 个月。

4. 使用前请往 RPE 加入 4 倍等体积的无水乙醇。

5. DNase I 母液： 使用注射器和针往干分装 DNase I 加入 550μlRNase-free 水。颠倒混匀， 不要涡旋震荡。 DNase I 可以收藏在-20℃ 收藏 9 个月； 2℃-8℃  6 周。不能反复冻溶。

内容来源：QIAGEN 凯杰