鼠卵细胞DNA的提取
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一、试剂:
TNE :
10mmol/L Tris cL (ph 8.0)
100 mmol/L NaCl
1 mmol/L EDTA
10%的SDS
酚、氯仿、乙醇
二、操作步骤:
(1)收集鼠卵细胞,PBS 漂洗3次;
(2)将细胞悬浮于500 ul的TNE缓冲液中;
(3)加入6 ul20mg/ml蛋白酶K和50ul10%SDS,轻缓摇动;
(4)37℃保存1-4小时;
(5)加入等体积250ul饱和酚和氯仿,轻摇15-20分钟,1200rpm离心5分钟,用大口径吸管转移上清;
(6)用2倍体积的乙醇(室温),轻摇至DNA出现;
(7)12000rpm离心10 min,20ul TE溶解。
个人心得:
1. 卵细胞与一般的培养细胞系明显不同,收集卵细胞后一般都是在显微镜下计数细胞的个数,常常只有几十个或上百个细胞,所以裂解前要尽量少带其它液体。
2. 卵细胞表面的颗粒细胞等要去除干净。消化时用的胰酶或透明酯酸酶要尽量去除。
一、小鼠卵细胞的收集(适用于 昆明小鼠,BALB/c)
1、第一天PM5:30 7.5IU PMSG注射,第三天PM5:30 即48小时后,7.5IUHCG注射,第四天8:30即15小时后,杀鼠取卵子;用0.1%胰酶去处透明带;
二、卵细胞培养有关的培养基:
1、M2和TYH
M2 TYH
NaCl 553.4 697.6
KCl 35.6 35.6
CaCl2 H2O 25.1 25.1
KH2PO4 16.2 16.2
MgSO4 7H2O 29.3 29.3
NaHCO3 33.6 210.6
HEPES 500.5
Lactic acid(Sodium salt) 435.2(60%的溶液0.39ml)
Pyruvic acid(Sodium salt) 3.6 11
Glucose 100.2 100.2
BSA 400 400
庆大霉素 20000IU(500ul) 20000IU(500ul)
用去离子水做溶剂,配完要过滤,整个过程要无菌操作。M2和TYH用之前要预温,培养卵时TYH应做成液滴预温2小时
2 、CZB 单位(mg/100ml)
NaCl 447.0
KCl 36.0
CaCl22H2 O 25.0
KH2PO4 16.1
MgSO4 7 H2 O 29.1
NaHCO3 211.1
60%乳酸钠 0.58ml
丙酮酸钠 3.0
BSA 500
青霉素 6.0
链霉素 5.0
1%酚红 100ul4.1
EDTA Na2 4.1