外泌体提取纯化（血清-血浆）

器材：高速离心机（可达到 12 000 rpm 转速）、涡旋振荡器、制冰机。

试剂：Solution A（-18 ℃ 保存）20 mL、Solution B（常温保存）5 mL、Exosome Purification Filter 20 Tubes、PBS 缓冲液；

耗材：1.5 mL 离心管。

一、样品预处理：

1、离心机在使用前先于 4 ℃ 预冷 10 min；

2、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 2 ~ 8 ℃ 条件下进行解冻；如果是新鲜样品，收集样品后置于 2~8 ℃ 保存；

3、将样品按照 500 μL /管进行分装，不足部分用 1×PBS 补足至 500 μL。样品类型单管处理体积血清/血浆 0.5 mL /管。

二、去除杂蛋白：

1、Solution A 从试剂盒中取出后，放置到冰箱冷冻层中至少 1 小时以上，取出预冷的 Solution A 置于碎冰上；

2、加 Solution A：在 500 μL 血液样品中加入 400 μL 预冷的 Solution A，立即将离心管盖紧，通过涡旋振荡器充分混匀 30 s；

3、离心去蛋白：将混匀后的样品于 4 ℃ 以 12 000 rpm 离心 20 min，去除样品中的杂蛋白；

4、上清液转移：去除杂蛋白的离心上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中；

三、提取外泌体：

1、加 Solution B：在去除杂蛋白的离心上清液中加入 120 μL 的 Solution B；

2、溶液混合：加入 Solution B 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器充分混匀 2 min；再放置于室温下静置 5 min；

3、沉淀外泌体：将装有混合液的离心管于 4 ℃ 以 12 000 rpm 离心 15 min，弃上清；

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4 ℃ 以 12 000 rpm 离心 2 min，弃上清（注：尽可能吸净上清液），并将 1.5 mL 离心管于室温下敞口静置 10 min；

5、外泌体重悬：取 200 μL 的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中；

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4 ℃ 以 12 000 rpm 离心 5 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒；（注：此时可能有较多沉淀，为正常现象）

四、纯化外泌体：

1、外泌体纯化：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4 ℃ 以 5 600 rpm 离心 20 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF 柱不可重复使用）

2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50~100 μL 进行分装保存于 -80 ℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。