外泌体提取纯化（血清-血浆）

器材：高速离心机, 涡旋振荡器

试剂：Solution A （-18℃ 保存）_20_mL，Solution B （常温保存）_6 mL， PBS 缓冲液

耗材： 1.5 mL 离心管，Exosome Purification Filter _20_Tubes 

一、样品预处理

1、离心机在使用前先于 4℃ 预冷 10 min；

2、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上，如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

3、将样品按照 500 μL 每管进行分装，不足部分用 1×PBS 补足至 500 μL；

4、离心去细胞碎片：将样品转移至 1.5 mL 离心管中，于4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpm）离心 10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；

 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL 离心管），下同。

5、离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 10 min，去除样品中的杂质碎片；

6、上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。

二、去除杂蛋白

1、加 Solution A：在 500 μL 血液样品中加入 400 μL 预冷的 Solution A，立即将离心管盖紧，通过涡旋振荡器充分混匀 30 s；

2、离心去蛋白：将混匀后的样品于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 20 min，去除样品中的杂蛋白；

3、上清液转移：去除杂蛋白的离心上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中；

三、 提取外泌体

1、加 Solution B：在去除杂蛋白的离心上清液中加入 120 μL 的 Solution B；

2、溶液混合： 加入 Solution B 试剂后将离 心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃ 静置 30 min 以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h）；

3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 15 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒（尽可能吸尽上清液）；

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以12,000 ×g（~12,400 rpm）离心2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；

5、外泌体重悬： 取适量的  1 × PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 500 μL 血清血浆用 200 μL 左右 1×PBS 重悬）；

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可 12,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。

四、纯化外泌体

1，外泌体纯化：将收获的外泌体颗粒粗品 转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上 室中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpm）离心 10 min ，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒（注：EPF 柱不可重复使用）;

2，外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。