合作专家 | 徐颖博士
结构生物学 中国科学技术大学
材料与仪器
器材：高速离心机，涡旋振荡器
试剂：Exosome Concentration Solution _120_mL，1 × PBS 缓冲液（无菌），Umibio 外泌体提取试剂盒（细胞上清液）
耗材：50 mL离心管，1.5 mL 离心管，Exosome Purification Filter * 20 Tubes
步骤
一、样品预处理
1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25 ℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；
2、样品初始用量：单次提取时的样品量建议细胞培养上清液不低于 20 mL；
3、离心去细胞颗粒：将样品转移至离心管中，于 4℃以3,000 ×g（~5,200 rpm）离心 10 min，去除样品中的细胞碎片；（注：若沉淀较多，可3000 g，10 min离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液。）
4、离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）离心10 min，去除样品中的杂质碎片；
5、上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。
二、提取外泌体
1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）
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样品名称 |
样品剂量 加入 ECS 剂量 |
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细胞培养上清液 |
20 mL 5 mL |
2、溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃ 静置 8 h 以上；（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过24h。）
3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10000 ×g （~9,500 rpm）离心 60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）
4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）离心2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；
5、外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 20 mL 细胞培养上清用 200 μL 左右 1×PBS 重悬）；
6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以 12000 ×g （~12,400 rpm）离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可12,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。
三、纯化外泌体
1、纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3000 ×g （~6,200 rpm）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒（注：EPF 柱不可重复使用）；
2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以 50-100 μL 体积进行分装保存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后继实验使用。
来源：丁香实验
