合作专家 | 徐颖博士
结构生物学 中国科学技术大学
材料与仪器
器材:高速离心机(可达到 10 000 g 离心力)、涡旋振荡器、2 mL 离心转子;
试剂:Exosome Concentration Solution * 100 mL、1 × PBS 缓冲液(无菌);
耗材:1.5 mL 离心管、Exosome Purification Filter * 20 Tubes。
步骤
一、样品预处理
1、取样:如果是冻存样品,从冰箱取出后于 25 ℃ 水浴中进行解冻,将完全融化后的样品置于冰上;如果是新鲜样品,收集样品后置于冰上;
2、样品初始用量:(单次提取时的样品量)
样品名称 | 最低量 |
细胞培养上清液 | 20 mL |
3、离心去细胞碎片:将样品转移至离心管中,于 4 ℃ 以 3 000 g 离心 10 min,去除样品中的细胞碎片;(注:若沉淀较多,可 3 000 g/10 min 离心多次至无明显沉淀,每次取离心上清液)
4、上清液转移:去除细胞碎片的离心上清液转移到新的 50 mL 离心管中;
二、提取外泌体
1、上清液预处理:在去除杂质的离心上清液中加入 Exosome Concentration Solution(ECS 试剂),具体的加入剂量如下:(其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算)
样品名称 | 样品剂量 | 加入 ECS 剂量 |
细胞培养上清液 | 20 mL | 5 mL |
2、溶液混合:加入 ECS 试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀 1 min,再放置于 4 ℃ 静置至少 2 h;(增加静置时间可提高外泌体得率,但静置时间不可超过 24 h)
3、沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于 4 ℃ 以 10 000 g 离心 60 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;(注:尽可能吸净上清液)
4、外泌体重悬:取 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物(具体加入剂量如下表),待其溶解后,将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中;
细胞上清样品体积 | 加入 PBS 剂量 |
20 mL | 0.2 mL |
注:其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算
5、收获外泌体颗粒:将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4 ℃ 以 12 000 g 离心 2 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。(注:若沉淀较多,可 12 000 g /2 min 离心多次至无明显沉淀,每次取离心上清液)
三、纯化外泌体
1、纯化外泌体:将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中,于 4 ℃ 以 3 000 g 离心 10 min,离心后收集 EPF 柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒;(注:EPF 柱不可重复使用)
2、外泌体的保存:纯化后的外泌体以 50~100 μL 进行分装保存于 -80 ℃ 低温冰箱中,以备后继实验使用。
来源:丁香实验