利用高温PCR体系改善高（G+C）含量DNA模板的PCR扩增

DNA 模板形成的二级和三级结构，在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构，将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件，使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶，便可以扩增高（G + C）含量 DNA 模板。

利用高温 PCR 体系改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是高（G + C）含量 DNA 模板形成的二级和三级结构，在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构，将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件，使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶，便可以扩增高（G + C）含量 DNA 模板。

器材：

480 DNA Thermal Cycler （Perkin Elmer， Norwalk， CT， USA）、电泳仪。

试剂：

① Taq DNA 聚合酶和 dNTP （Stratagene 公司）

② 琼脂糖（Promega 公司）

③ Tris、HC1、KC1、MgCl2，明胶等均为分析纯

利用高温 PCR 体系改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理的基本过程可分为如下几步：

A 引物设计根据基因序列设计如下引物。
正向：5'-TTGCCTCGCTCCGTCTCGCAGCC

反向：5'-AGCACGGAGAAGGATGGGGCGCG

以此引物扩增的部分原癌基因 c-myc 火序列长度为 179 bp，（G + C）含量为 76%。

B 模板制备母鸡输卵管基因组 DNA，从三周龄已注射雌二醇的来亨鸡（leghorn hen）中分离提取。

C 反应体系按下列配方添加各种成分至 200 μL 薄壁管：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.3）， 50 mmol/L KC1，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 g/L 明胶，0.8 pmol/L 引物，0.2 mmol/L dNTP， 100 ng/μL 以模板，5% 甲酰胺。用水补足至总体积 10 μL。
上述 PCR 混合液在沸水浴煮沸 5 min，冷却至室温，按 0.065 U/μL 加 Taq DNA 聚合酶。

D 反应条件按下面条件进行 30 个循环扩增：94 ℃ 1 min， 70 ℃ 5 min。

E 产物鉴定 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

1 用两步热 PCR 扩增，要求引物 Tm 值较高，否则不能与模板结合，一般情况下引物冗值在 70〜75 ℃。

2 用 cDNA 或克隆于质粒的 DNA 作模板，虽然 PCR 扩增较容易一些，用常规的三步 PCR 方法也能获得产物，但在产量和专一性方面较差。

3 对于有些模板［如多巴胺受体基因，75% （G + C）］变性温度要求更高，要达到 98 ℃。在使用高变性温度时，要使用热稳定的 DNA 聚合酶，如 Vent （New England Biolab）或者是原 产菌株生产的 Pfu （Stratagene） （Stratagene 重组 Pfu 效果很差）。

4 退火和延伸温度一般在 70〜76℃之间，超过 76 ℃几乎没有 PCR 产物。

5 使用热 PCR 方法时，可能是引物与模板结合效率很低，或者是酶的效率降低，使退火和 延伸时间较长一些，若这部分时间短于 5 min，几乎没有 PCR 产物。